本文關(guān)鍵詞：光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射構(gòu)建大鼠顱內(nèi)靜脈竇血栓形成模型的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景：顱內(nèi)靜脈竇血栓形成(Cerebral venous sinus thrombosis, CVST)是一組由多種病因所導(dǎo)致罕見(jiàn)的腦靜脈系統(tǒng)疾病,其臨床癥狀復(fù)雜多變,且嚴(yán)重危害到人類的生命。由于皮層靜脈及靜脈竇主干形成血栓,能夠繼發(fā)性引起腦水腫、缺血性腦損傷、腦出血、顱內(nèi)高壓、昏迷、神經(jīng)功能缺陷甚至死亡。成年人每年發(fā)病率為4-5/10萬(wàn)人,兒童每年的發(fā)病率為7/100萬(wàn)人。并且,CVST的發(fā)病率在逐年增高,約占腦血管意外疾病1%。其發(fā)病原因有口服避孕藥、妊娠、產(chǎn)褥期等,約75%的患者為成年女性。近年來(lái),隨著診斷技能、神經(jīng)影像技術(shù)、治療技術(shù)的發(fā)展,超過(guò)80%的病人都得到了良好的預(yù)后。近年來(lái),CVST動(dòng)物模型被用于血腦屏障破壞、腦水腫形成等病理生理變化研究及藥物治療效果評(píng)估。然而,目前所建立的CVST動(dòng)物模型的手段及病理生理研究結(jié)果有較大的差異性,一個(gè)穩(wěn)定的CVST動(dòng)物模型需具備以下特性：1、能夠模擬人類CVST的病理生理變化特點(diǎn)；2、CVST的階段性變化與人類保持一致；3、提供一個(gè)可供評(píng)估治療效果的測(cè)試平臺(tái)。然而,迄今為止仍然缺少能夠完全滿足上述特點(diǎn)的動(dòng)物模型方案。目前國(guó)內(nèi)的研究通過(guò)以下幾種方式來(lái)構(gòu)建CVST動(dòng)物模型：1、上矢狀竇單純結(jié)扎或阻塞法；2、結(jié)扎上矢狀竇后注射促凝物質(zhì)；3、單純凝血酶注射4、血管介入球囊阻塞下注射凝血酶；5、氯化鐵(FeCl3)溶液濕敷。已有研究證實(shí),血栓所累及的皮層靜脈及橋靜脈越多,其腦損傷程度越大。皮層靜脈及橋靜脈堵塞后,血流無(wú)法通過(guò)側(cè)支循環(huán)進(jìn)行代償,可引起靜脈缺血性腦梗死。然而,上述動(dòng)物模型構(gòu)建方法都無(wú)法在避免永久結(jié)扎靜脈竇的情況下,使得靜脈竇及皮層靜脈同時(shí)形成血栓。光敏劑在腦血管循環(huán)時(shí),在激發(fā)光照射下,可產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng),從而釋放氧自由基,氧自由基是一種有害的代謝物質(zhì),能夠造成生物膜系統(tǒng)損傷及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化障礙。一方面,氧自由基可與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化物增加可破壞PGI2與TXB2的平衡,促進(jìn)血小板聚集粘附,激活凝血過(guò)程。另一方面,自由基也可損傷內(nèi)皮細(xì)胞,使血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜脫落,暴露出內(nèi)皮下層的基底膜,內(nèi)皮下層富含氨基葡聚糖與膠原物質(zhì),能夠促進(jìn)血小板的粘附與聚集。內(nèi)皮細(xì)胞受損后白細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附,加重?fù)p傷,形成惡性循環(huán),最終在血管中形成血栓。光化學(xué)法的血栓形成過(guò)程與人類腦血栓形成發(fā)病機(jī)制、血栓形成過(guò)程、損害程度較為相近,加之光照或光敏劑對(duì)血管本身不存在機(jī)械性損害,與臨床上的血栓性疾病的病理、生理上的發(fā)病機(jī)制極為相似。光化學(xué)法形成的血栓富含紅細(xì)胞、血小板及纖維蛋白,類似于臨床上靜脈紅色血栓的病理結(jié)構(gòu)。該方法可造成血小板聚集及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,為抗血小板聚集藥和抗血栓藥物及預(yù)防血栓藥物的研究提供可能性,因而可廣泛用于CVST等腦血管病的基礎(chǔ)與臨床研究。本課題旨在現(xiàn)有CVST動(dòng)物模型的研究基礎(chǔ)上,在通過(guò)光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射的方式構(gòu)建一個(gè)可用于基礎(chǔ)、臨床試驗(yàn)研究的大鼠上矢狀竇.皮層靜脈血栓模型,從而提供一個(gè)有利于深入CVST疾病研究及治療效果評(píng)估的平臺(tái)。顱內(nèi)靜脈竇血栓形成是一種罕見(jiàn)的、多病因的靜脈缺血性腦卒中,發(fā)病率僅占所有中風(fēng)的0.5%,然而血栓形成于靜脈的不同位置、皮層靜脈及橋靜脈的受累與否使得臨床癥狀出現(xiàn)多樣性,缺乏特征性,早期的影像學(xué)特征不明顯又給診斷添加了不少難度,容易漏診甚至誤診。近年來(lái),隨著診斷技術(shù)及治療手段的發(fā)展,CVST的診斷率提高,大多數(shù)患者能夠得到早期治療,預(yù)后良好,死亡率大大下降。然而CVST的發(fā)病機(jī)理及生理病理學(xué)研究尚未透徹,有待進(jìn)一步深入探索。CVST的病理生理改變是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,其動(dòng)態(tài)改變?cè)谂袛嗉膊☆A(yù)后發(fā)展過(guò)程中顯得尤為重要,目前國(guó)內(nèi)外少有相關(guān)報(bào)道。在本研究中,我們通過(guò)光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射形成穩(wěn)定、可重復(fù)的CVST動(dòng)物模型并通過(guò)觀察血腦屏障通透性、腦水腫、腦損傷和神經(jīng)功能狀態(tài)在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)改變,探索CVST不同發(fā)展階段的病理生理學(xué)特點(diǎn),為于臨床治療提供理論基礎(chǔ)并對(duì)疾病的發(fā)展作出預(yù)后判斷。第一部分光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射構(gòu)建大鼠CVST模型研究目的：構(gòu)建一種新型CVST動(dòng)物模型,檢測(cè)血栓形成的位置及范圍,為評(píng)估模型穩(wěn)定性、可重復(fù)性及探索大鼠CVST模型的病理生理動(dòng)態(tài)改變奠定基礎(chǔ)。研究方法：將Wistar成年大鼠麻醉后,放置在保暖毯,維持體溫約37攝氏度,進(jìn)行靜脈置管。置管完畢后將大鼠擺置呈俯臥位,腦立體定向固定。頭部正中切皮2cm,雙氧水腐蝕筋膜及肌肉暴露骨面,于前囟及人字縫之間設(shè)計(jì)骨窗,在外科顯微鏡觀察下,邊用高速顱骨鉆鉆開(kāi)骨窗,邊用生理鹽水冷卻。擴(kuò)大骨窗,保留硬腦膜,暴露上矢狀竇、皮層靜脈及部分腦皮層。開(kāi)啟全固態(tài)半導(dǎo)體激光器,固定光源位置,并確定激光照射位置,將孟加拉玫瑰紅溶液以1mg/kg/min的速度經(jīng)尾靜脈緩慢注射,即用波長(zhǎng)532nm、功率密度15 mw/mm2、直徑1mm光斑的激光束照射距后囟0.5mm的上矢狀竇尾端處及距前囟0.5mm的上矢狀竇頭端處,各持續(xù)10min,觀察到照射處血管形成棕黑色血凝塊。隨后穿刺上矢狀竇頭端,緩慢注射凝血酶,持續(xù)10min后拔出穿刺針。使用血管熒光造影法檢測(cè)血栓形成范圍。研究結(jié)果：凝血酶注射15min后,在模型組中,通過(guò)外科顯微鏡可觀察到上矢狀竇及皮層靜脈血液凝結(jié)成暗紅色血凝塊。熒光體視顯微鏡下觀察到無(wú)造影劑殘留的上矢狀竇、橋靜脈及皮層靜脈呈黑色顯影,而對(duì)照組無(wú)明顯的血栓形成及黑色顯影。研究結(jié)論：通過(guò)光化學(xué)法產(chǎn)生的自由基可損傷內(nèi)皮細(xì)胞,使血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜脫落,暴露出內(nèi)皮下層的基底膜,內(nèi)皮下層富含氨基葡聚糖與膠原物質(zhì),能夠促進(jìn)血小板的粘附與聚集,激活凝血過(guò)程,誘導(dǎo)上矢狀竇頭尾兩端血栓形成。通過(guò)凝血酶注射,使凝血酶擴(kuò)散至橋靜脈及皮層靜脈中,使血管中的血液凝結(jié)。通過(guò)外科顯微鏡鏡下觀察及血管熒光造影法證實(shí)了血栓在上矢狀竇、橋靜脈及皮層靜脈中形成,從而建立起大鼠上矢狀竇-皮層靜脈模型。第二部分探索大鼠CVST模型的病理生理動(dòng)態(tài)改變研究目的：建立大鼠上矢狀竇-皮層靜脈模型,檢測(cè)其血腦屏障完整性、腦含水量、神經(jīng)功能、腦梗死體積、梗死部位的血管及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化情況。研究方法：將143只Wistar成年大鼠隨機(jī)分為模型組,假手術(shù)組,控制對(duì)照組,在不同分組中根據(jù)研究的時(shí)間點(diǎn)分為第1天、第2天、第7天3個(gè)亞組。根據(jù)不同分組進(jìn)行處理,在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠麻醉,并灌注固定,取大鼠上矢狀竇、硬腦膜及大腦組織,應(yīng)用依文思藍(lán)熒光染色在熒光顯微鏡下觀察大腦皮層的血腦屏障完整性改變情況；通過(guò)干濕重法測(cè)定腦的含水量,了解腦水腫程度變化；轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的神經(jīng)功能改變；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫組化測(cè)定腦梗死的體積及范圍；免疫組化法檢測(cè)梗死部位的血管生成情況及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量改變。研究結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組及控制對(duì)照組相對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組大鼠大腦皮層處血腦屏障及神經(jīng)功能在術(shù)后第1天時(shí)受損,且在第2天時(shí)損傷程度加重,同時(shí)伴隨著腦水腫,然而在第7天時(shí),血腦屏障完整性、腦含水量及神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)正常；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫組化顯示大鼠在術(shù)后第1天出現(xiàn)腦梗死,在第2天時(shí)腦梗死體積達(dá)到最大,同時(shí)可見(jiàn)腦缺血壞死、出血、腦水腫等病理改變,隨后在第7天時(shí)梗死體積逐漸縮��；免疫組化結(jié)果顯示微血管數(shù)量在術(shù)后第1天、第2天保持恒定,而星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量在第1天、第2天時(shí)顯著減少,但在第7天時(shí),微血管及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常組及模型組。研究結(jié)論：證實(shí)了通過(guò)光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射構(gòu)建的大鼠CVST模型能夠模擬人體CVST的病理生理改變,通過(guò)探索大鼠CVST模型不同疾病發(fā)展階段的病理生理改變,為臨床治療提供了干預(yù)契機(jī),從而減少致殘率及死亡。
【關(guān)鍵詞】：顱內(nèi)靜脈竇血栓形成 動(dòng)物模型 血腦屏障 腦水腫 光化學(xué)反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-26
• 參考文獻(xiàn)23-26
• 第一部分 光化學(xué)法聯(lián)合凝血酶注射構(gòu)建大鼠CVST模型26-39
• 一、引言26-27
• 二、實(shí)驗(yàn)材料和方法27-32
• 三、結(jié)果32-33
• 四、討論33-36
• 小結(jié)36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 第二部分 探索大鼠CVST模型的病理生理動(dòng)態(tài)改變39-64
• 一、引言39-40
• 二、實(shí)驗(yàn)材料和方法40-50
• 三、結(jié)果50-56
• 四、討論56-60
• 小結(jié)60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 全文總結(jié)64-66
• 中英文縮略詞66-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-71

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