本文關(guān)鍵詞：弓形蟲TgPRMT5基因的克隆鑒定，細(xì)胞定位及功能初步分析

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【摘要】：一.研究背景弓形蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞原蟲,能夠感染幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞。據(jù)估計(jì)全球約有1/3的人口受到弓形蟲的威脅,某些地區(qū)血清陽(yáng)性率甚至可高達(dá)80%。弓形蟲是一類重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲。慢性感染弓形蟲后,機(jī)體免疫力正常的宿主主要表現(xiàn)為無(wú)任何臨床癥狀的隱性感染；而在一些免疫功能下降或受抑制的宿主如腫瘤患者、艾滋病人等的體內(nèi),“休眠”的蟲體則會(huì)迅速增生繁殖,破壞宿主細(xì)胞而引起多器官、多臟器的損害,嚴(yán)重者可導(dǎo)致宿主死亡。若宿主孕期感染弓形蟲,可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形等,幸存者也常遺留智能低下等嚴(yán)重后遺癥。因此弓形蟲也是一中分別廣泛可引起人獸共患病的寄生原蟲。弓形蟲機(jī)會(huì)性致病的生物學(xué)基礎(chǔ)是速殖子和緩殖子的相互轉(zhuǎn)化。速殖子在宿主免疫系統(tǒng)或相關(guān)藥物的作用下可轉(zhuǎn)換為緩慢增殖的緩殖子,以包囊的形式長(zhǎng)期潛伏于腦組織中。然而目前臨床上治療弓形蟲病的藥物如乙胺嘧啶、乙酰螺旋霉素、復(fù)方新諾明等或者細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等,對(duì)包囊內(nèi)的緩殖子卻幾乎沒有殺滅作用。因此,闡明弓形蟲速殖子和緩殖子相互轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制,可發(fā)現(xiàn)防治弓形蟲病的新途徑。弓形蟲速殖子在轉(zhuǎn)化為緩殖子的過(guò)程中,會(huì)發(fā)生形態(tài)和生理代謝的巨大改變,那么必然伴隨有大量基因表達(dá)的變化。在高等生物中,這些變化通常是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的,然而有研究發(fā)現(xiàn)在頂復(fù)門寄生蟲包括弓形蟲與瘧原蟲其基因組中只有很少的轉(zhuǎn)錄因子序列,這提示,在這些頂端的真核生物中必然還存在著其他的調(diào)控途徑。在真核生物中,表觀遺傳基因調(diào)控是一種重要的基因調(diào)控方式。而組蛋白這樣一類與染色質(zhì)緊密連接的小分子蛋白的翻譯后的修飾更是一種重要的表觀遺傳基因調(diào)控方式。通過(guò)分析弓形蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)弓形蟲存在全套編碼組蛋白及組蛋白修飾酶的基因序列。而近期Kami.Kim教授的團(tuán)隊(duì)對(duì)弓形蟲組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),弓形蟲組蛋白存在豐富的翻譯后修飾現(xiàn)象如甲基化修飾與乙酰化修飾等。這些都說(shuō)明組蛋白修飾調(diào)控基因表達(dá)在弓形蟲中也起著極為重要的作用。精氨酸甲基化修飾是一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的蛋白翻譯后修飾現(xiàn)象,隨著近十年以來(lái)對(duì)其深入的研究,其重要地位越來(lái)越受到大家的重視。而催化此類反應(yīng)的正是蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein arginine methyltransferases, PRMTs),它通過(guò)轉(zhuǎn)移S-腺苷甲硫氨酸上的甲基進(jìn)而對(duì)靶蛋白進(jìn)行甲基化修飾。PRMTs主要分為2型,Ⅰ型可催化生產(chǎn)不對(duì)稱二甲基,Ⅱ型形成對(duì)稱二甲基。目前發(fā)現(xiàn)弓形蟲基因組中存在編碼5種PRMTs的基因序列,其中TgPRMT1可甲基化修飾弓形蟲的Argonaute蛋白以及組蛋白H4R3,而TgCARM1通過(guò)修飾組蛋白H3R17可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)進(jìn)而影響到速殖子與緩殖子間的轉(zhuǎn)化。剩下的TgPRMT3、TgPRMT5未見有相關(guān)研究報(bào)道。PRMT5屬于Ⅱ型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。在哺乳動(dòng)物中,普遍發(fā)現(xiàn)PRMT5可甲基化修飾組蛋白H2A、H3、H4進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。本文旨在,通過(guò)分析PRMT5在弓形蟲中的生物學(xué)特點(diǎn),探索它對(duì)弓形蟲基因表達(dá)的影響。二.目的1.克隆鑒定弓形蟲PRMT5全長(zhǎng)基因片段,構(gòu)建克隆載體PEASY-Blunt-Zero-PRMT5,并對(duì)比分析PRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中的表達(dá)水平；2.觀察PRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中的亞細(xì)胞分布；3.檢測(cè)TgPRMT5的酶學(xué)活性以及尋找其靶蛋白；4.觀察TgPRMT5表達(dá)量的改變對(duì)弓形蟲的影響。三.方法1.收集Pru株及RH-PRMT5-HAX3株弓形蟲速殖子與緩殖子總RNA,以此為模板RT-PCR擴(kuò)增PRMT5基因的全長(zhǎng)片段,構(gòu)建克隆載體PEASY-Blunt-Zero-PRMT5對(duì)PRMT5進(jìn)行測(cè)序鑒定。并通過(guò)Real time-RT-PCR以及Western blotting檢測(cè)PRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中的表達(dá)水平。2.以轉(zhuǎn)基因蟲株RH-PRMT5-HAX3中TgPRMT5蛋白C-末端的HA-標(biāo)簽為檢測(cè)蛋白,采用間接免疫熒光方法觀察TgPRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中的亞細(xì)胞分布。分別提取速殖子胞漿與胞核蛋白,并以Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.利用HA-標(biāo)簽進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)收集RH-PRMT5-HAX3蟲株中內(nèi)源性TgPRMT5蛋白復(fù)合物。將此蛋白復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜分析尋找TgPRMT5的靶蛋白4.提取弓形蟲核蛋白,通過(guò)Western blot觀察H4R3以及H3R26位點(diǎn)是否存在對(duì)稱二甲基化修飾5. RT-PCR擴(kuò)增TgH3與TgH4基因的全長(zhǎng)片段,構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-32a-H3與PET-32a-H4。將這些重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用Western blotting以及SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物6.采用Ni-NTA純化收集rTgH3蛋白7.以純化收集的rTgH3蛋白與牛的核心組蛋白包括H2A、H2B、H3和H4為反應(yīng)底物,S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,與收集內(nèi)源性TgPRMT5進(jìn)行體外甲基化實(shí)驗(yàn),并通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)最終結(jié)果8.構(gòu)建質(zhì)粒TUB-CAT-PRMT5,將其轉(zhuǎn)染野生型RH株弓形蟲以建立PRMT5表達(dá)量上調(diào)的模型.Real time-RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蟲株中PRMT5的表達(dá)水平。收集其總RNA進(jìn)行表達(dá)譜分析,觀察此模型中弓形蟲基因表達(dá)的變化9.構(gòu)建質(zhì)粒pSAG1::CAS9-U6::sgPRMT5,將其轉(zhuǎn)染野生型RH株弓形蟲。嘗試篩選出PRMT5基因沉默的陽(yáng)性蟲株。四.結(jié)果1. RT-PCR擴(kuò)增了RH蟲株與Pru蟲株TgPRMT5基因并進(jìn)行了測(cè)序鑒定,發(fā)現(xiàn)RH株此基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中GT1蟲株同源性為100%,而Pru蟲株的同源性為99%。2.通過(guò)RT-PCR及熒光定量PCR對(duì)比發(fā)現(xiàn),PRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子期均有表達(dá),在同型弓形蟲速、緩殖子間表達(dá)量有差異,緩殖子期表達(dá)量高于速殖子期。且在不同型蟲株間表達(dá)量有巨大差異,RH株表達(dá)量約為Pru株80倍。3.采用抗HA. tag的抗體,IFA檢測(cè)RH-PRMT5-HAX3蟲株中TgPRMT5蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在速殖子期,TgPRMT5蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中；而在緩殖子期,TgPRMT5蛋白則主要分布于細(xì)胞核中。分別提取速殖子的胞漿與胞核蛋白,采用Western blot檢測(cè),也得到了相同的結(jié)果,即在速殖子期,TgPRMT5蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。4.采用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在弓形蟲體內(nèi)H3R26以及H4R3位點(diǎn)存在對(duì)稱二甲基修飾。5.構(gòu)建表達(dá)載體PET-32a-H3與PET-32a-H4,成功誘導(dǎo)了rTgH3與rTgH4蛋白的表達(dá)。并通過(guò)Ni-NTA純化柱獲得了rTgH3與rTgH4蛋白。6.通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn),收集了RH-PRMT5-HAX3蟲株中的TgPRMT5蛋白復(fù)合物,質(zhì)譜分析鑒定到了100多個(gè)蛋白,其中包括了可能是TgPRMT5作用底物的組蛋白H4、H2A以及一些轉(zhuǎn)綠相關(guān)蛋白等7.體外甲基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TgPRMT5可對(duì)H4R3與H3R26位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)稱二甲基修飾。8.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒TUB-CAT-PRMT5后,在野生型RH株弓形蟲中建立了PRMT5表達(dá)量上調(diào)的模型。9.成功構(gòu)建了用于敲除TgPRMT5基因的重組質(zhì)粒pSAGl::CAS9-U6::sgPRMT5以及PRMT5同源片段質(zhì)粒PBlue-PRMT5 up-DHFR-PRMT5 down。五.結(jié)論本研究首次對(duì)弓形蟲中的TgPRMT5基因進(jìn)行了克隆與鑒定。TgPRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中均有表達(dá),無(wú)論是Pru蟲株還是RH-PRMT5-HAX3蟲株,其速殖子與緩殖子中該基因的表達(dá)量均均有差異,緩殖子期高于速殖子期。且RH-PRMT5-HAX3蟲株的表達(dá)量明顯高于Pru蟲株(P0.0001)。TgPRMT5在弓形蟲速殖子與緩殖子中的亞細(xì)胞定位有顯著差異,速殖子期主要分布于細(xì)胞質(zhì),而緩殖子期則主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。該結(jié)果也提示TgPRMT5在弓形蟲不同時(shí)期可能行使不同的功能,組蛋白可能是其修飾的靶蛋白之一。對(duì)弓形蟲核蛋白進(jìn)行甲基化檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)H4R3以及H3R26位點(diǎn)存在對(duì)稱二甲基修飾,而體外甲基化實(shí)驗(yàn),也證明了TgPRMT5可甲基化修飾組蛋白H4R3與H3R26位點(diǎn),在TgPRMT5沉淀復(fù)合物的質(zhì)譜分析中也鑒定到了組蛋白。以上結(jié)果均提示,在體內(nèi)情況下,TgPRMT5可能對(duì)組蛋白H4R3與H3R26位點(diǎn)進(jìn)行了甲基化修飾。TgPRMT5過(guò)表達(dá)模型的成功建立可為更深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 甲基化修飾 弓形蟲組蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R382.5
【目錄】：

• 摘要3-8
• Abstract8-17
• 前言17-21
• 第一章 實(shí)驗(yàn)材料與方法21-52
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材21-22
• 1.2 TgPRMT5核酸序列22
• 1.3 蟲株、細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 1.4 溶液22-26
• 1.5 主要儀器26-27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-52
• 2.0 宿主細(xì)胞HFF的培養(yǎng)27
• 2.1 弓形蟲Pru株緩殖子的收集與接種27-28
• 2.2 弓形蟲Pru株速殖子的收集與接種28
• 2.3 弓形蟲RH-PRMT5-HAX3蟲株速殖子的體外培養(yǎng)28-29
• 2.4 弓形蟲RH-PRMT5-HAX3蟲株緩殖子的體外誘導(dǎo)29
• 2.5 PEASY-Blunt-Zero-PRMT5載體的構(gòu)建29-34
• 2.5.1 PCR引物的設(shè)計(jì)29
• 2.5.2 總RNA提取29-30
• 2.5.3 總RNA去基因組處理30
• 2.5.4 目的基因PRMT5的RT-PCR擴(kuò)增與純化回收30-32
• 2.5.5 連接及轉(zhuǎn)化32-33
• 2.5.6 陽(yáng)性重組子的鑒定33-34
• 2.6 RT-Real Time PCR檢測(cè)弓形蟲速、緩殖子中PRMT5的表達(dá)量34-35
• 2.7 Westernblot檢測(cè)PRMT5在RH-PRMT5-HAX3蟲株速、緩殖子的表達(dá)水平35-36
• 2.8 PRMT5在RH-PRMT5-HAX3蟲株的速、緩殖子中的亞細(xì)胞定位36-38
• 2.8.1 免疫熒光(IFA)檢測(cè)PRMT5的亞細(xì)胞定位,步驟如下36-37
• 2.8.2 Western blotting驗(yàn)證PRMT5在速殖子中的亞細(xì)胞定位37-38
• 2.9 內(nèi)源性PRMT5蛋白的收集38-40
• 2.10 PRMT5免疫沉淀復(fù)合物鑒定40-41
• 2.10.1 SDS-PAGE凝膠的銀染色40
• 2.10.2 Western blotting分析PRMT5免疫沉淀符合物40-41
• 2.11 構(gòu)建原核表運(yùn)載體PET-32a-T巧3/ TgH441-42
• 2.11.1 Tg朋與TgH4基因全長(zhǎng)片段的RT-PCR擴(kuò)增及純化回收41
• 2.11.2 PET-32a-TgH3/TgH4的構(gòu)建41-42
• 2.11.3 陽(yáng)性重組子PET-32a-TgH3/TgH4的篩選與鑒定42
• 2.12 重組質(zhì)粒PET-32a-TgH3/TgH4在大腸埃希菌中的表達(dá)42-43
• 2.13 重組表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳43
• 2.14 表達(dá)產(chǎn)物考馬斯亮藍(lán)染色以及Western blot分析43
• 2.15 純化收集重組表達(dá)蛋白43-44
• 2.16 PRMT5體外甲基化實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.17 甲基化反應(yīng)產(chǎn)物及弓形蟲核蛋白Western blot分析45
• 2.18 TgPRMT5表達(dá)量上調(diào)模型的建立45-48
• 2.18.1 過(guò)表達(dá)載體TUB-CAT-PRMT5的構(gòu)建45-46
• 2.18.3 質(zhì)粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT中量提取46-47
• 2.18.4 重組質(zhì)粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT轉(zhuǎn)染RH株速殖子47-48
• 2.18.5 Real Time RT-PCR檢測(cè)PRMT5表達(dá)量48
• 2.19 TgPRMT5表達(dá)量上調(diào)模型的建立48-52
• 2.19.1 重組質(zhì)粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的構(gòu)建與鑒定48-49
• 2.19.2 PRMT5同源片段的構(gòu)建49
• 2.19.3 重組質(zhì)粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5轉(zhuǎn)染RH株速殖子49-50
• 2.19.4 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定50-52
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-73
• 1 弓形蟲精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶TgPRMT5基因的克隆、鑒定及其在速殖子與緩殖子期表達(dá)量的比較52-56
• 1.1 PRMT5基因的克隆與鑒定52-53
• 1.2 Real Time RT-PCR檢測(cè)PRMT5基因在弓形蟲速、緩殖子中的表達(dá)量53-55
• 1.3Westernblot檢測(cè)TgPRMT5在RH-PRMT5-HAX3蟲株速殖子與緩殖子中的表達(dá)水平55-56
• 2 PRMT5在弓形蟲的亞細(xì)胞定位56-58
• 2.1 免疫熒光(IFA)檢測(cè)PRMT5的亞細(xì)胞定位56-57
• 2.2 Western blot驗(yàn)證PRMT5在速殖子中的亞細(xì)胞定位57-58
• 3 PRMT5酶學(xué)活性檢測(cè)58-66
• 3.1 弓形蟲核蛋白對(duì)稱二甲基化修飾位點(diǎn)的檢測(cè)58-59
• 3.2 PRMT5免疫沉淀復(fù)合物鑒定59-60
• 3.3 rTgH3與rTgH4的重組表達(dá)與純化60-65
• 3.4 PRMT5二甲基化修飾組蛋白H3與H465-66
• 4 TgPRMT5表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)后對(duì)弓形蟲的影響66-73
• 4.1 重組質(zhì)粒TUB-CAT-PRMT5的構(gòu)建66-67
• 4.2 PRMT5表達(dá)量上調(diào)模型中PRMT5表達(dá)量的檢測(cè)67-68
• 4.3 質(zhì)粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的構(gòu)建68-70
• 4.4 同源片段的構(gòu)建70-73
• 第三章 結(jié)論與討論73-76
• 全文總結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 碩士期間研究成果82-83
• 致謝83-84

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10 陳西岐;劉秀蘭;張克功;于德順;;貓弓形蟲病的診治[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 本報(bào)記者 白軼南;弓形蟲病 危及胎兒健康[N];保健時(shí)報(bào);2005年

2 臨城縣畜牧局 李路民;豬得弓形蟲病 吃了貓的虧[N];河北科技報(bào);2002年

3 北京友誼醫(yī)院北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所研究員 甘紹伯 副主任醫(yī)師 馮曼玲;弓形蟲——寵物的“寵物”[N];健康報(bào);2000年

4 連孝華;孕婦玩貓狗易危害胎兒[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

5 林曉麗;養(yǎng)貓者易感染弓形蟲應(yīng)謹(jǐn)防患精神分裂癥[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2007年

6 小郭;弓形蟲病危害不輕[N];中國(guó)商報(bào);2000年

7 戴培紅;北京友誼醫(yī)院探索治療弓形蟲病的新途徑[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

8 本報(bào)記者 蔡玉冰 通訊員 黃賢君;弓形蟲沒你想的可怕[N];廣東科技報(bào);2012年

9 李水源;當(dāng)前豬場(chǎng)弓形蟲病的防控[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2013年

10 王志海 邵芹;犬弓形蟲病[N];中國(guó)畜牧報(bào);2003年

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本文編號(hào)：944301