本文關(guān)鍵詞：c-Met阻斷劑抑制產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌胞內(nèi)感染機制的研究

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【摘要】：一、研究背景產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)簡稱單增李斯特菌,是李斯特菌屬內(nèi)唯一對人類致病的菌種。在臨床治療中,盡管抗生素已經(jīng)有效地應(yīng)用于各種感染性疾病的治療,但是面對LM感染所導(dǎo)致的高致病率和高病死率,我們往往素手無策。LM對人體的感染多發(fā)生于免疫力低下的人群,如老年人、兒童、孕婦、長期服用免疫抑制劑的病人及患有免疫系統(tǒng)疾病的人群等等。LM的感染多由于消化道感染引起,攝入被LM污染的食物后,產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可粘附并侵襲腸道上皮細(xì)胞,其入侵腸道的重要毒力因子是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌表面的內(nèi)化素B(Internalin B, InlB)。InlB可模擬肝生長因子或分散因子(Hepatocyte growth factor/Scatter factor)與存在于腸道上皮表面的肝生長因子受體或分散因子受體(Hepatocyte growth factor receptor/Scatter factor receptor/ c-mesenchymal-epithelial transition factor c-Met)結(jié)合, 以與天然配體HGF/SF/c-Met相同的方式,激發(fā)連續(xù)的信號級聯(lián)放大,誘導(dǎo)c-Met β鏈上的酪氨酸殘基轉(zhuǎn)磷酸,包括c-Met的激活,Gabl、Cbl和Shc的募集和磷酸化,及包含有銜接子和PI3K亞單位的p85復(fù)合體形成,并侵入胞內(nèi)造成進(jìn)一步的感染。腸道上皮細(xì)胞無吞噬能力,LM進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞后可長期生存并于細(xì)胞內(nèi)增殖。LM可引發(fā)細(xì)胞與細(xì)胞之間的感染,并可穿越腸道細(xì)胞進(jìn)入血液,隨血液循環(huán)到全身各組織器官后,引起多發(fā)性感染,其中最多見的李斯特菌病為腦膜炎、敗血癥、妊娠婦女流產(chǎn)、局灶性感染等等。腦膜炎是李斯特菌感染所引起的最嚴(yán)重的并發(fā)癥,具有較高的致死率。由于血腦屏障最重要的組成部分為人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells, BMECs),因此LM對于HBMEC的侵襲是李斯特菌腦病發(fā)生必備條件,其發(fā)生的關(guān)鍵步驟是存在于血液循環(huán)中的LM到達(dá)腦部并穿越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)�？偠灾�,產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌引起腦膜炎需要以下幾個必要的條件：首先,免疫系統(tǒng)功能較低的人群攝入被LM污染的食物后,LM黏附和侵襲腸道上皮細(xì)胞,并在腸道上皮內(nèi)長期生存和增殖；其次,LM侵襲腸道細(xì)胞后穿越腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血壓循環(huán),發(fā)生嚴(yán)重的敗血癥并造成全身多器官和組織感染；最后,LM侵襲腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,在胞內(nèi)生長增殖并穿越血腦屏障,導(dǎo)致腦膜炎的發(fā)生。LM是一種胞內(nèi)寄生菌,胞內(nèi)菌又分為專性胞內(nèi)菌和兼性胞內(nèi)寄生菌。專性胞內(nèi)菌僅寄居于活細(xì)胞內(nèi),而兼性胞內(nèi)菌既可生存于活細(xì)胞內(nèi)又可寄居于無生命的胞外環(huán)境。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種兼性胞內(nèi)菌,胞內(nèi)和胞外皆可生存,對營養(yǎng)和溫度的要求較低,通常在4-C條件下也可增殖,因此LM具有較強的生存能力,且導(dǎo)致食物中LM具有較高的污染率,人群中LM具有較高的感染率。目前抗生素廣泛而有效地應(yīng)用于各種感染性疾病的治療,但是針對李斯特菌感染的治療藥物則僅僅為青霉素類、頭孢菌素類、磺胺甲嗯唑等胞外抗生素,這些抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)殺菌并且存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌可以逃避機體的免疫防御及清除等問題使得LM感染人體后導(dǎo)致較高的發(fā)病率和病死率。面對LM感染缺乏有效治療藥物的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),我們圍繞LM毒力因子內(nèi)化素B(InlB)可模擬HGF/SF與其配體HGF/SF受體結(jié)合,從而導(dǎo)致細(xì)菌入侵無吞噬能力的上皮細(xì)胞并引起一系列信號通路的激活這一機制,提出利用c-Met受體阻斷劑以阻斷InlB與c-Met結(jié)合,研究c-Met受體阻斷劑在抑制LM對宿主細(xì)胞的侵襲以預(yù)防和治療LM感染的過程中扮演的角色。我們知道,格爾德霉素(Geldanamycin,GA)是一種經(jīng)典的c-Met受體抑制劑,但是其水溶性較低,同時肝毒性和腎毒性較高等缺點導(dǎo)致目前在臨床治療中很少使用。然而,格爾德霉素類似物(Geldanamycin analogues,GAA)如替拉替尼(17-allylaminogeldanamycin,17-AAG)、17.二甲胺乙胺基.17.去甲氧基格爾德霉素(17-dimethy-laminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-DMAG)等,卻比格爾德霉素具有更高的的水溶性、更低的肝毒性、腎毒性等,因此可作為一種潛在的阻斷LM結(jié)合于細(xì)胞表面的c-Met受體抑制劑以進(jìn)行研發(fā)。同時經(jīng)查閱資料得知另一種新型c-Met受體阻斷劑卡博替尼(cabozantinib, XL-184), XL-184于2012年獲FDA批準(zhǔn)上市用于臨床疾病治療。XL-184具有較長的藥物半衰期,較GA更低的藥物副作用,面對LM嚴(yán)重感染素手無策的困境,不失為一種較好的策略,因此XL.184也可作為一種潛在的預(yù)防和治療LM感染的新型抗菌藥物進(jìn)行研發(fā)。因此,根據(jù)上述線索,本文主要從以下幾個方面開展研究：(1)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2 cells)及HBMECs,從而研究17-AAG和XL-184在阻止LM侵襲Caco-2細(xì)胞和HBMEC中所起的作用；(2)將Caco-2細(xì)胞和HBMEC接種于Transwell小室,并測量17-AAG和XL.184孵育后單層細(xì)胞的跨膜電阻和滲透性,從而研究c-Met受體阻斷劑卡在保護(hù)細(xì)胞屏障的完整性中所扮演的角色；(3)體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和HBMEC,并使用熒光染色技術(shù)(DAPI/PI)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放水平檢測技術(shù),從而研究在17-AAG和XL.184的介入下,LM所致細(xì)胞凋亡率的變化情況。二、研究方法1、檢測LM濃度并繪制LM與OD值的相關(guān)曲線將LM培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取100μl菌液于離心機中離心,轉(zhuǎn)速10000 rpm,去上清。將細(xì)菌沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液(即PBS)中。菌液濃度稀釋至1×10-1-10并于紫外分光光度計600 nm處測量OD值。將各濃度的菌液取100 ul涂布于無抗生素的BHI固體平板上,37℃孵箱孵育24 h,計數(shù)菌落數(shù)量,并分析菌落數(shù)量、菌液各稀釋度與OD值之間的關(guān)系。2、c-Met受體阻斷劑作用下LM生長曲線的測定配制體積為5 m1分別含XL.184濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10 μM的BHI液體培養(yǎng)基,同時于培養(yǎng)基中加入100μl處于對數(shù)生長期的LM,37℃、200 rpm搖床中孵育LM。分別于0、2、4、6、8、10、12、14和16 h取100μl菌液于96孔板中,酶標(biāo)儀600 nm波長處測量吸光度值。以時間為橫坐標(biāo),以A600處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制LM生長曲線。3、研究LM對Caco-2和HBMEC的侵襲實驗人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2及HBMEC體外培養(yǎng)于24孔板,待細(xì)胞匯合成單層(約105/孔)后進(jìn)行試驗。實驗方法為：細(xì)胞單層加入無抗生素的培養(yǎng)基和LM(約107/孔,使細(xì)胞感染倍數(shù)為100),37℃、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min,無菌PBS洗三次,加入含慶大霉素100 μg/ml的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1 h,達(dá)到抑制胞外細(xì)菌的作用。再用無菌PBS洗三遍,取100 μl/孔0.5%Triton X-100于24孔板,孵育8 min后,立即加入50μl蒸餾水中止Triton X-100的裂解作用。裂解液梯度稀釋(10’.104)后涂板培養(yǎng),24 h后計數(shù)并計算LM侵襲率。4、c-Met受體阻斷劑單獨或與氨芐西林聯(lián)合作用下LM對Caco-2和HBMEC的侵襲實驗為了研究c-Met受體阻斷劑17-AAG和XL-1 84在阻止LM侵襲Caco-2和HBMEC中所起的作用,首先體外培養(yǎng)Caco-2和HBMEC于24孔板,待細(xì)胞匯合成單層(約105/孔)并形成緊密連接后,于不同的時間、不同濃度的17-AAG和XL.184單獨或與氨芐西林(Ampicillin, AMP)聯(lián)合孵育Caco-2和HBMEC,孵育完畢后加入LM(約107/孔,使細(xì)胞感染倍數(shù)為100),洗單層細(xì)胞三次并加入含有慶大霉素100μg/ml的培養(yǎng)基孵育1h,再次洗單層細(xì)胞三次后用0.5%TritonX.100裂解細(xì)胞,裂解液梯度稀釋(10-1-10-4)后涂板培養(yǎng),24 h后計數(shù)并計算LM侵襲率。5、c-Met受體阻斷劑作用下單層細(xì)胞通透性的檢測Caco-2和HBMEC接種于Transwell小室上層,生長于聚碳酸酯膜的Caco-2或HBMEC,其細(xì)胞膜上的緊密連接結(jié)構(gòu)形成一道相對緊密的屏障以阻止小分子物質(zhì)通過細(xì)胞單層,并可將transwell分為上下室,Caco-2和HBMEC可分別視為模擬血.腸屏障和血.腦屏障。接種Caco-2和HBMEC的上層小室分別加入含不同濃度XL.184的MEM培養(yǎng)基和含不同濃度的17-AAG的1640培養(yǎng)基,孵育24 h,無菌PBS洗細(xì)胞三次,加入細(xì)菌(MOI=100)孵育1.5h,隨后加入HRP 3μg于37℃孵育。分別于0、2、4、6 h從下層取30μl培養(yǎng)基涂布于不含抗生素的BHI固體平板,然后將培養(yǎng)基置于37-C細(xì)菌培養(yǎng)箱中24 h后觀察并計數(shù)菌落數(shù)量。酶標(biāo)儀于405 nm處測量檢測下室MEM和1640培養(yǎng)基中HRP的濃度。電阻儀測量TEER值以觀察單層細(xì)胞通透性的改變情況。從下室取出培養(yǎng)基用于檢測后應(yīng)加入同等體積的無菌培養(yǎng)基,使得下室培養(yǎng)基體積始終保持為2ml。6、c-Met受體阻斷劑作用下細(xì)胞內(nèi)LDH釋放水平的檢測含不同濃度XL.184的MEM培養(yǎng)基,不同濃度17-AAG的1640培養(yǎng)基分別孵育Caco-2和HBMEC 1、24 h,無菌PBS洗細(xì)胞三次,培養(yǎng)基中加入1×107LM(MOI=100),37*(2孵育1.5 h,取10 ul上清于96孑L板中,用于測量上清LDH濃度。然后加入0.5% TritonX-100裂解細(xì)胞,取10 ul細(xì)胞裂解液于96孔板,用于測量細(xì)胞內(nèi)LDH含量。LDH含量測定步驟、方法、原理依據(jù)檢測試劑盒說明書,于450 nm下檢測吸光度。7、c-Met受體阻斷劑作用下細(xì)胞存活率檢測含有2.5、0.5、OμM XL-184和含有1000、250、0nM 17-AAG的培養(yǎng)基分別孵育Caco-2和HBMEC 24 h,無菌PBS洗三次,加入1×107 LM(MOI=100),37-C孵育細(xì)胞1.5 h,高壓滅菌過的PBS清洗3遍,暗室內(nèi)加入稀釋的DAPI染液15 μl和稀釋的PI染液15 μl,并置于暗室使其充分作用30 min,隨后于OLYMPUS激光共聚焦熒光顯微鏡上機檢測細(xì)胞的存活情況。8、統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,統(tǒng)計學(xué)方法采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析及兩因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,各實驗至少重復(fù)三遍。三、結(jié)果1、c-Met阻斷劑對體外LM生長曲線無影響在不同時間下,含不同濃度XL.184的BHI液體培養(yǎng)基中,LM的生長情況無差異。實驗組與對照組相比,LM生長曲線形狀相似,無統(tǒng)計學(xué)差異。2、致病菌LM對Caco-2細(xì)胞和HBMEC的侵襲率高于非致病菌DH5a、 BL21(DE3)對于Caco-2細(xì)胞：LM侵襲率約為0.168%,高于對照組DH5a的侵襲率0.019%(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.023%(P=0.000)。對于HBMEC:LM侵襲率約為0.129%,高于對照組DH5a的侵襲率0.024%(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.027%(P=0.000)。3、c-Met阻斷劑可降低LM對于Caco-2細(xì)胞及HBMEC的侵襲率藥物組侵襲率均低于對照組(P=0.000)。隨XL-184濃度升高,LM對Caco-2、 HBMEC的侵襲率降低。相同劑量藥物作用下,XL.184孵育Caco-2細(xì)胞1,2,6,12 h即可降低LM的侵襲率。XL-184孵育HBMEC 1,2,6h即可降低LM的侵襲率。隨17-AAG濃度增高,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。17-AAG孵育細(xì)胞1 h即可明顯降低LM對Caco-2的侵襲。4、XL-184與AMP聯(lián)合用藥對于抑制LM侵襲Caco-2、HBMEC的效果優(yōu)于XL-184單獨用藥各濃度XL.184分別與50 μg/ml AMP共孵育Caco-2細(xì)胞24 h；實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0～10.01,P50.05)；隨XL-184劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。各濃度Amp分別與0.1 μM XL-184共孵育Caco-2細(xì)胞24 h；實驗組LM對細(xì)胞的侵襲率均低于對照組(P0.01)；且隨氨芐西林劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。各濃度XL.184分別與50 μg/ml氨芐西林共孵育HBMEC 24 h,實驗組LM對細(xì)胞的侵襲率低于對照組(P=0.000)：隨XL-184劑量增大,LM對HBMEC的侵襲率有下降趨勢。各濃度Amp分別與0.1 μM XL-184共孵育細(xì)胞24 h,實驗組LM對細(xì)胞的侵襲率均低于對照組(P=0.000)；隨氨芐西林劑量增大,LM對HBMEC的侵襲率有下降趨勢。5、17-AAG與氨芐西林聯(lián)合用藥對于抑制LM侵襲Caco-2的效果優(yōu)于17-AAG單獨用藥各濃度17-AAG分別與50 μg/ml Amp共孵育細(xì)胞24 h,實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0=0.000,P50～1000.05,P250～5000.01)；隨17-AAG劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。各濃度AMP分別與50 nM 17-AAG共孵育細(xì)胞24 h,實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0=0.000,P50.01,P25～500.05,P1000.05)；且隨藥物劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。6、XL-184可保護(hù)Caco-2細(xì)胞和HBMEC的通透性隨XL-184孵育Caco-2濃度升高TEER值下降減緩(P0.05),下室培養(yǎng)基中HRP濃度降低,并且LM數(shù)量變少(P=0.000)。同時隨LM侵襲Caco-2細(xì)胞時間的延長,TEER值降低幅度增大,下室HRP濃度升高,下室細(xì)菌數(shù)量增多。隨XL-184孵育HBMEC濃度升高TEER值下降減弱(P0.05),下室培養(yǎng)基中HRP濃度降低,并且進(jìn)入下室的LM數(shù)量變少(P0.01)。同時也可觀察到隨LM侵襲HBMEC時間的延長,TEER值降低幅度增大,下室HRP濃度升高,下室細(xì)菌數(shù)量增多。7、17-AAG可保護(hù)Caco-2細(xì)胞的通透性隨17-AAG濃度升高TEER值下降減緩(P0.05),下室培養(yǎng)基中HRP濃度降低(P=0.000),并且LM數(shù)量變少(P0.05)。同時隨LM侵襲Caco-2細(xì)胞時間的延長,TEER值降低幅度增大,下室HRP濃度升高,下室細(xì)菌數(shù)量增多。8、XL-184可降低Caco-2細(xì)胞和HBMEC的LDH釋放水平提前孵育Caco-2細(xì)胞1、24 h,藥物組LDH釋放率均低于對照組,藥物濃度越高LDH釋放率下降趨勢越明顯(1 h.P10.05,P2.5～100.01),(24h：P0.1～100.01)。提前孵育HBMEC 1、24 h,藥物組的LDH釋放率低于對照組,藥物濃度越高LDH釋放率有下降趨勢越明顯(1h：P0.5～100.01),(24h：P05～10=0.000)。9、17-AAG可降低Caco-2細(xì)胞的LDH釋放水平提前孵育1、24 h,藥物組LDH釋放率低于對照組,藥物濃度越高LDH釋放率下降趨勢越明顯(1h：P10000.001),(24 h：P250.10000.001)。10、XL-184可降低LM所致Caco-2細(xì)胞和HBMEC死亡率各濃度XL.184提前孵育Caco-2細(xì)胞,熒光染色結(jié)果：不同濃度組細(xì)胞存活率具有差異,兩兩比較,藥物組細(xì)胞存活率大于對照組(P0.01)。各濃度XL-184提前孵育HBMEC,熒光染色結(jié)果：不同濃度組間細(xì)胞存活率具有差異,兩兩比較,藥物組細(xì)胞存活率大于對照組(P0.01)。11、17-AAG可降低LM所致Caco-2細(xì)胞死亡率不同濃度17-AAG組細(xì)胞存活率具有差異,兩兩比較,藥物組細(xì)胞存活率大于對照組(P=0.000)。結(jié)論1、c-Met阻斷劑在體外不能抑制LM的生長2、c-Met阻斷劑可降低LM對于細(xì)胞的侵襲3、c-Met阻斷劑與青霉紊類抗生素聯(lián)合應(yīng)用可有效降低LM對于細(xì)胞的侵襲4、c-Met阻斷劑通過降低LM對于細(xì)胞的侵襲進(jìn)而抑制LM對細(xì)胞所產(chǎn)生的有害作用5、c-Met阻斷劑通過降低LM介導(dǎo)的有害作用提高細(xì)胞的存活率
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌 c-Met阻斷劑 胞內(nèi)感染 HBMEC Caco-2細(xì)胞 侵襲 細(xì)胞通透性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-26
• 前言26-30
• 第一章 c-Met阻斷劑在抑制產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌侵襲體外腸道屏障模型中的作用30-51
• 1.1 材料30-33
• 1.1.1 菌株及細(xì)胞30
• 1.1.2 主要試劑30
• 1.1.3 主要儀器30-31
• 1.1.4 主要培養(yǎng)基和常用試劑的配制31-33
• 1.2 方法33-37
• 1.2.1 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的培養(yǎng)與保存33
• 1.2.2 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌濃度的測量33-34
• 1.2.3 Caco-2細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與凍存34
• 1.2.4 XL-184作用下LM生長曲線的測量34-35
• 1.2.5 致病菌LM與非致病菌DH5a、BL21(DE3)對Caco-2細(xì)胞的侵襲實驗35
• 1.2.6 c-Met作用下LM對于Caco-2細(xì)胞的侵襲實驗35-36
• 1.2.7 c-Met阻斷劑作用下單層Caco-2細(xì)胞通透性檢測36
• 1.2.8 c-Met阻斷劑作用下Caco-2細(xì)胞內(nèi)LDH釋放水平檢測36
• 1.2.9 c-Met阻斷劑作用下LM介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞毒力作用分析36-37
• 1.3 統(tǒng)計學(xué)分析37
• 1.4 結(jié)果37-49
• 1.4.1 XL-184在體外對于LM的生長曲線無影響37-38
• 1.4.2 致病菌LM對Caco-2細(xì)胞的侵襲率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)38
• 1.4.3 XL-184可降低LM對于Caco-2細(xì)胞的侵襲率38-39
• 1.4.4 XL-184與氨芐西林聯(lián)合用藥降低LM侵襲Caco-2細(xì)胞的效果優(yōu)于XL-184單獨用藥39-40
• 1.4.5 XL-184可保護(hù)Caco-2單層細(xì)胞的通透性40-42
• 1.4.6 XL-184可降低LM介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞LDH釋放水平42
• 1.4.7 XL-184可降低LM所致Caco-2細(xì)胞死亡率42-43
• 1.4.8 17-AAG可降低LM對于Caco-2細(xì)胞的侵襲率43-44
• 1.4.9 17-AAG與氨芐西林聯(lián)合用藥降低LM侵襲Caco-2細(xì)胞的效果優(yōu)于17-AAG單獨用藥44-45
• 1.4.10 17-AAG可保護(hù)Caco-2單層細(xì)胞的通透性45-47
• 1.4.11 17-AAG可降低LM介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞LDH釋放水平47-48
• 1.4.12 17-AAG可降低LM所致Caco-2細(xì)胞死亡率48-49
• 1.5 討論49-51
• 第二章 XL-184阻斷劑在抑制產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌侵襲體外血腦屏障模型中的作用51-66
• 2.1 材料52-55
• 2.1.1 菌株及細(xì)胞52
• 2.1.2 主要試劑52
• 2.1.3 主要儀器52-53
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基和常用試劑的配制53-55
• 2.2 方法55-57
• 2.2.1 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的培養(yǎng)與保存55
• 2.2.2 HBMEC的復(fù)蘇、傳代與凍存55-56
• 2.2.3 致病菌LM與非致病菌DH5a、BL21(DE3)對HBMEC的侵襲實驗56
• 2.2.4 XL-184作用下LM對于HBMEC的侵襲實驗56
• 2.2.5 XL-184作用下單層HBMEC單層細(xì)胞通透性檢測56-57
• 2.2.6 XL-184作用下HBMEC細(xì)胞內(nèi)LDH釋放水平檢測57
• 2.2.7 XL-184作用下LM介導(dǎo)的HBMEC毒力作用分析57
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析57-58
• 2.4 結(jié)果58-63
• 2.4.1 致病菌LM對HBMEC的侵襲率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)58
• 2.4.2 XL-184可降低LM對于HBMEC的侵襲率58-59
• 2.4.3 XL-184與氨芐西林聯(lián)合用藥降低LM侵襲HBMEC的效果優(yōu)于XL-184單獨用藥59-60
• 2.4.4 XL-184可保護(hù)Caco-2單層細(xì)胞的通透性60-62
• 2.4.5 XL-184可降低LM介導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞LDH釋放水平62
• 2.4.6 XL-184可降低LM所致HBMEC細(xì)胞死亡率62-63
• 2.5 討論63-66
• 全文總結(jié)66-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 中英文縮略詞表73-74
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文74-75
• 致謝75-77

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6 楊濤,孔垂?jié)?李芳,劉同才,王平;腎盂輸尿管癌C-met基因mRNA表達(dá)及意義[J];中華泌尿外科雜志;2000年06期

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2 杜蕾;c-Met阻斷劑抑制產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌胞內(nèi)感染機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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4 李蔓;c-met在良性，癌前和惡性外陰腫瘤中的表達(dá)及意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

5 胡建華;肝細(xì)胞生長因子受體（c-met）胞外區(qū)突變體的真核表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2005年

6 孫愛學(xué);以c-Met為靶點的新型抑制劑的設(shè)計與合成研究[D];南京理工大學(xué);2014年

7 關(guān)新紅;c-Met基因在新疆哈族、漢族食管鱗狀細(xì)癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2014年

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9 張延曙;c-Met、VEGF和PDGF在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2002年

10 任婧;RNAi技術(shù)抑制胃癌MKN-45細(xì)胞c-Met基因及PI3K/AKT信號通路的研究[D];中南大學(xué);2012年

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本文編號：905178