本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌干擾巨噬細(xì)胞自噬的初步研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 CRISPR 基因編輯 自噬 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)生存

【摘要】：由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結(jié)核病是世界上最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。盡管宿主細(xì)胞存在著多種清除結(jié)核分枝桿菌的策略,但結(jié)核分枝桿菌也進(jìn)化出了對(duì)抗宿主細(xì)胞殺傷作用的生存機(jī)制。研究表明,細(xì)胞自噬與結(jié)核分枝桿菌的相互斗爭(zhēng),是影響該菌能否在宿主細(xì)胞中生存的重要因素。然而,參與這一過(guò)程的細(xì)菌和宿主相關(guān)基因仍未得到詳細(xì)的闡釋。本研究以結(jié)核分枝桿菌作為研究對(duì)象,通過(guò)構(gòu)建青色或藍(lán)色熒光表達(dá)菌株和雙熒光指示自噬的巨噬細(xì)胞系以及一套能夠抑制和激活真核基因表達(dá)的CRISPRi/CRISPRa系統(tǒng)作為研究工具,以此來(lái)揭示調(diào)控結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞中存活的相關(guān)基因。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.青色/藍(lán)色熒光結(jié)核分枝桿菌H37Ra的構(gòu)建。為了方便利用熒光顯微鏡對(duì)結(jié)核分枝桿菌的直接觀察,我們將能夠表達(dá)青色或者藍(lán)色熒光蛋白的pMV261-CFP/BFP質(zhì)粒導(dǎo)入到結(jié)核分枝桿菌H37Ra中。通過(guò)篩選,得到了能夠穩(wěn)定表達(dá)青色或藍(lán)色熒光的結(jié)核分枝桿菌。2.雙熒光指示自噬的巨噬細(xì)胞系的構(gòu)建。首先,我們將EGFP基因突變?yōu)镚FPph使其對(duì)pH環(huán)境更加敏感,并與mCherry和LC3基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)。之后,利用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù),將GFPph-mCherry-LC3融合基因插入到Raw264.7細(xì)胞基因組中。通過(guò)多輪的挑斑篩選以及流式技術(shù)的純化,我們獲得了高陽(yáng)性率的GphML-Raw264.7細(xì)胞。通過(guò)對(duì)基因組的測(cè)序以及Western Blot技術(shù)驗(yàn)證相關(guān)蛋白的表達(dá),確認(rèn)細(xì)胞系的構(gòu)建成功。最后,利用自噬誘導(dǎo)劑進(jìn)行驗(yàn)證,確認(rèn)該細(xì)胞系可以有效地指示自噬的發(fā)生。3.結(jié)核分枝桿菌蛋白對(duì)自噬干擾的分析。為了探究哪些細(xì)菌蛋白通過(guò)干預(yù)自噬而參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌長(zhǎng)期潛伏于巨噬細(xì)胞,我們將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的33個(gè)結(jié)核相關(guān)蛋白與GphML-Raw264.7細(xì)胞進(jìn)行共孵育,通過(guò)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬發(fā)生,在特定時(shí)間點(diǎn)利用激光共聚焦顯微鏡分析自噬的發(fā)生狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rv0847處理細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)與紅色熒光點(diǎn)可以共定位,說(shuō)明Rv0847可以干擾自噬體與溶酶體的融合。以上結(jié)果說(shuō)明Rv0847可能干擾自噬溶酶體的融合,從而參與結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活。4.宿主自噬基因gRNA文庫(kù)的構(gòu)建。利用CRISPRi/CRISPRa技術(shù),我們可以在真核細(xì)胞基因組上抑制或者激活基因的表達(dá)。我們將該系統(tǒng)及相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)果顯示其可有效地激活或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)。之后,我們篩選了所有參與到自噬過(guò)程中的相關(guān)基因,并通過(guò)NCBI獲取基因附近的所有序列信息。通過(guò)在線分析軟件獲取最佳gRNA序列。將得到的gRNA序列分別插入到CRISPRi和CRISPRa質(zhì)粒中,得到關(guān)于宿主自噬基因gRNA的文庫(kù)。進(jìn)而為下一步探究結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活的相關(guān)宿主自噬基因奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 CRISPR 基因編輯 自噬 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)生存
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略詞表10-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 引言12
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的相互作用12-16
• 1.1.1 細(xì)胞免疫與結(jié)核分枝桿菌13
• 1.1.2 自噬與結(jié)核分枝桿菌13-14
• 1.1.3 活性氧成分與結(jié)核分枝桿菌14-15
• 1.1.4 結(jié)核分枝桿菌在宿主中的生存機(jī)制15-16
• 1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因敲入和基因干擾中的應(yīng)用16-19
• 1.2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)與基因敲入17-18
• 1.2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)與真核細(xì)胞基因干擾18-19
• 1.3 雙熒光指示系統(tǒng)與細(xì)胞自噬19-22
• 1.3.1 pH敏感型GFP19-20
• 1.3.2 串聯(lián)蛋白GFPph-mCherry-LC3與自噬監(jiān)視20-22
• 第二章 目的與意義22-23
• 第三章 材料與方法23-39
• 3.1 試驗(yàn)材料23-27
• 3.1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件23
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材23-24
• 3.1.3 主要的工具酶、抗體及試劑24-25
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基、抗生素及其配置25-26
• 3.1.5 緩沖液及其配置26-27
• 3.1.6 主要的生物學(xué)分析軟件27
• 3.2 試驗(yàn)方法27-39
• 3.2.1 結(jié)核分枝桿菌H37Ra及恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài)的制備27
• 3.2.2 結(jié)核分枝桿菌的電擊轉(zhuǎn)化27
• 3.2.3 sgRNA的設(shè)計(jì)及合成27-28
• 3.2.4 G418篩選濃度及維持濃度的確定28-29
• 3.2.5 Raw264.7 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及后期篩選29
• 3.2.6 雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分析29-30
• 3.2.7 CRISPRi/CRISPRa系統(tǒng)的構(gòu)建30-31
• 3.2.8 細(xì)胞基因組的提取31
• 3.2.9 Western Blot實(shí)驗(yàn)31-32
• 3.2.10 以氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞32-33
• 3.2.11 相關(guān)引物的設(shè)計(jì)及合成33-34
• 3.2.12 常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)34-39
• 第四章 技術(shù)路線39-40
• 第五章 結(jié)果和分析40-50
• 5.1 結(jié)核分枝桿菌H37Ra表達(dá)CFP菌株的構(gòu)建與鑒定40-41
• 5.1.1 CFP重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建40
• 5.1.2 H37Ra的BFP/CFP熒光表達(dá)菌株的鑒定40-41
• 5.2 雙熒光巨噬細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證41-46
• 5.2.1 G418工作濃度的篩選41-42
• 5.2.2 CRISPR相關(guān)剪切質(zhì)粒的構(gòu)建42
• 5.2.3 EGFP基因序列的改造42-43
• 5.2.4 同源重組片段的克隆43
• 5.2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建及初步篩選43-45
• 5.2.6 細(xì)胞系GFPph-mCerry-LC3融合蛋白表達(dá)檢測(cè)45
• 5.2.7 細(xì)胞系指示自噬的功能驗(yàn)證45-46
• 5.3 干擾自噬相關(guān)結(jié)核蛋白的篩選46-47
• 5.4 鼠源自噬基因gRNA文庫(kù)的構(gòu)建47-50
• 5.4.1 CRISPRi/CRISPRa系統(tǒng)功能驗(yàn)證47-48
• 5.4.2 相關(guān)鼠源自噬基因的篩選及gRNA設(shè)計(jì)48-50
• 第六章 討論與結(jié)論50-53
• 6.1 青色熒光結(jié)核分枝桿菌的構(gòu)建50-51
• 6.2 雙熒光巨噬細(xì)胞系的構(gòu)建51-52
• 6.3 結(jié)核蛋白R(shí)v0847對(duì)自噬的干擾的初步研究52
• 6.4 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 致謝63

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