本文關(guān)鍵詞：人轉(zhuǎn)錄因子PU.1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：目的 PU.1是調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞天然免疫功能的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。文中旨在構(gòu)建并鑒定表達(dá)人轉(zhuǎn)錄因子PU.1基因的重組腺病毒載體。方法將PU.1基因SPI1和真核表達(dá)載體p IRES-EGFP進(jìn)行雙酶切、連接酶連接,PCR擴(kuò)增目的片段SPI1-IRES-EGFP,與中間質(zhì)粒p DONR221和腺病毒骨架質(zhì)粒p Ad/CMV/V5-DEST進(jìn)行重組,線性化后轉(zhuǎn)染人胚腎293(HEK293)細(xì)胞,獲得重組腺病毒p AD-SPI1-IRES-EGFP,經(jīng)過(guò)大量擴(kuò)增后獲得高濃度的重組腺病毒。TCID 50法測(cè)定重組腺病毒滴度,通過(guò)熒光顯微鏡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time q PCR)鑒定PU.1基因在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果菌落PCR、酶切電泳及測(cè)序結(jié)果均表明重組腺病毒攜帶有正確的PU.1基因,TCID 50法計(jì)算腺病毒滴度為8×1011IU/m L,熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯的綠色熒光,Real-time q PCR轉(zhuǎn)染重組腺病毒組PU.1 mRNA表達(dá)量是轉(zhuǎn)染空病毒組的2189.93倍。結(jié)論成功構(gòu)建并獲得了高濃度的人轉(zhuǎn)錄因子PU.1基因重組腺病毒,為后續(xù)研究高表達(dá)PU.1在宿主抗煙曲霉感染中的天然免疫作用奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;上海市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科;
【關(guān)鍵詞】： PU. SPI 重組腺病毒 煙曲霉 天然免疫
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81270064,81200063)
【分類(lèi)號(hào)】：R3416
【正文快照】： 0引言人轉(zhuǎn)錄因子PU.1屬于轉(zhuǎn)錄因子Ets(E26-trans-formation-specific)家族,主要由脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1(spleen focus forming virus proviralintegration oncogene-1,SPI1)編碼[1],它主要表達(dá)于髓系細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等[2]。

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本文編號(hào)：807202