本文關鍵詞：PHB2在TH17細胞中的調控作用

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【摘要】：目的：TH17細胞不僅在細菌和真菌感染中具有重要保護作用,在自身免疫性疾病中也有重要作用。維甲酸相關孤兒核受體(Retinoid-related orphan receptor gammaT, RORγt)是TH17細胞關鍵性的轉錄因子,決定了TH17細胞的分化并誘導促炎因子如IL-17等的表達。通過前期質譜分析發(fā)現(xiàn)PHB2與RORγt具有相互作用,而PHB2是一種結構高度保守,分布廣泛,表達豐富的膜蛋白家族成員,且在T細胞活化過程中是上調的,形成磷酸化復合物定位于T細胞線粒體內膜上,對維持線粒體的完整性和T細胞的活化,分化和生存具有重要意義。故本研究通過免疫共沉淀,RNA干擾等技術,以期探討PHB2如何對TH17細胞分化發(fā)揮調控作用及其調控機制。方法：首先通過PCR技術擴增出PHB2完整序列,構建到HA-pIP表達質粒中,在人胚腎細胞HEK293T中共轉染Flag-RORγt與HA-PHB2,通過免疫共沉淀技術驗證PHB2與RORγt是否具有相互作用。構建約600bp大小的IL-17A啟動子報告基因,用PEI轉染法在HEK293T細胞系過表達PHB2,RORγt和報告基因,通過熒光素酶報告基因實驗探討PHB2對RORγt功能的影響。然后通過電轉法在人淋巴細胞白血病Jurkat細胞株中過表達PHB2, RORγt和報告基因,通過熒光素酶報告基因實驗探PHB2對RORγt功能的影響。設計兩對針對PHB2的特異性shRNA,構建包裝表達shRNA的慢病毒載體,同時構建一對過表達PHB2的慢病毒載體,兩者均通過PEI法與質粒△8.9,VSV-G共同轉染至HEK293T細胞中,48小時后收上清,通過超速離心法濃縮病毒備用。隨后通過ficoll法分離出新生兒臍帶血的PBMC,用試劑盒分選出Naive CD4+T細胞,體外誘導出TH17細胞。將針對PHB2的shRNA和過表達PHB2的慢病毒分別直接感染Flag-RORγt-Jurkat穩(wěn)轉株細胞和體外誘導分化出的TH17細胞,在病毒感染一周左右通過免疫印跡技術檢測PHB2與RORγt蛋白水平的變化,利用RT-PCR分析PHB2對TH17細胞相關炎癥因子基因水平的影響。結果：通過免疫共沉淀技術和免疫印跡結果可以看到相對于對照組,共轉染Flag-RORγt和HA-PHB2組通過加入anti-HA抗體后用anti-Flag抗體免疫印跡可以看到較強的RORγt信號(或加入anti-Flag抗體后用anti-HA抗體免疫印跡可以看到較強的PHB2信號)。由此結果可以得出PHB2與RORγt具有相互作用。在HEK293T細胞和Jurkat細胞中的IL-17A啟動子熒光素酶報告基因實驗中,我們發(fā)現(xiàn)PHB2能夠有效促進RORγt介導的IL-17A轉錄活性且成劑量依賴性。利用慢病毒形式過表達PHB2于Flag-RORγt-Jurkat穩(wěn)轉株細胞中,免疫印跡結果發(fā)現(xiàn)過表達PHB2蛋白可以增強RORγt蛋白水平的表達。在體外成功誘導出TH17細胞后,并且構建出針對PHB2的兩對shRNA都具有較好的沉默效率,在Flag-RORγt-Jurkat細胞和TH17細胞中感染針對PHB2的shRNA慢病毒后,免疫印跡結果分析得出PHB2蛋白水平明顯降低的同時,RORγt蛋白水平也有所下降。RT-PCR結果分析得出消減PHB2基因表達的同時TH17細胞炎癥相關基因IL-17A下調約25%,IL-17F下調約50%。結論：本課題通過免疫共沉淀和熒光素酶報告基因技術明確了PHB2與RORγt具有相互作用,且得出PHB2能夠促進RORγt介導的IL-17A啟動子轉錄活性。最后通過RNA干擾技術,RT-PCR和免疫印跡技術進一步探討了PHB2通過對RORγt的蛋白水平的調控從而影響TH17細胞相關細胞因子的轉錄水平,得出PHB2發(fā)揮對TH17細胞的正調控作用的結果。
【關鍵詞】：PHB2 RORγt RNA干擾 TH17細胞
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中英文縮寫對照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 前言11-17
• 2 材料17-21
• 3 實驗方法21-36
• 4 實驗結果36-45
• 5 討論45-48
• 6 結論48
• 7 參考文獻48-55
• 個人簡歷55-56
• 致謝56-57
• 綜述57-66
• 參考文獻62-66

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