本文關(guān)鍵詞：鐵蛋白基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的可誘導(dǎo)表達(dá)及MR成像

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【摘要】：背景與目的細(xì)胞活體示蹤是分子影像學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一,用于示蹤移植細(xì)胞的方法主要有磁標(biāo)記和報(bào)告基因成像兩種,其中以后者更具優(yōu)勢(shì)。鐵蛋白基因(FTH1)作為一種較為成熟的MRI報(bào)告基因已成功用于多種類(lèi)型細(xì)胞的示蹤研究。目前多數(shù)研究結(jié)果顯示,由于FTH1基因整合到細(xì)胞的基因組,其表達(dá)不受細(xì)胞分裂增殖的影響,但是否受干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響目前尚不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建攜帶FTH1基因的慢病毒載體,感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),將MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并檢測(cè)MSCs成神經(jīng)分化前后的FTH1表達(dá)情況,探討FTH1基因表達(dá)對(duì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化的影響,以及成神經(jīng)分化對(duì)FTH1基因表達(dá)的影響,明確FTH1在神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)的聚鐵能力是否能夠引起足夠的MRI信號(hào)改變,為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)體內(nèi)干細(xì)胞神經(jīng)分化的MRI活體示蹤奠定基礎(chǔ)。方法1攜載Tet-on可調(diào)控FTH1基因的慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝合成FTH1基因并插入到Tet-on可誘導(dǎo)表達(dá)慢病毒載體上,重組攜載可調(diào)控FTH1基因慢病毒質(zhì)粒(p LV-Tet-FTH1),PCR及DNA測(cè)序鑒定。再將p LV-Tet-FTH1載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,生產(chǎn)慢病毒(LV-Tet-FTH1)并測(cè)定滴度。2攜載Tet-on可調(diào)控FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1)建立以LV-Tet-FTH1轉(zhuǎn)染MSCs,構(gòu)建含有可調(diào)控FTH1報(bào)告基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1),嘌呤霉素篩選。3 FTH1在MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞的可誘導(dǎo)表達(dá)及聚鐵效應(yīng)在MSCs-Tet-FTH1的完全培養(yǎng)基內(nèi)加入梯度濃度的誘導(dǎo)劑(DOX)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)FTH1基因表達(dá)產(chǎn)物鐵蛋白,確定DOX最佳濃度和最佳時(shí)間。CCK-8試劑檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染和枸櫞酸鐵銨(FAC)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響,普魯士藍(lán)染色和電鏡觀察MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵效應(yīng),磁共振觀察細(xì)胞內(nèi)FTH1基因表達(dá)是否引起T2WI信號(hào)變化。4 MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)分化和鑒定采用全反式維甲酸和MNM神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞成神經(jīng)分化,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和微管蛋白-2(MAP-2)。5誘導(dǎo)分化后FTH1基因表達(dá)及聚鐵能力的檢測(cè)MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)分化后,Western Blot檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物鐵蛋白,普魯士藍(lán)色和透射電鏡檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的聚鐵能力,磁共振檢測(cè)T2WI信號(hào)變化。結(jié)果1攜載FTH1基因的可調(diào)控Tet-on慢病毒載體重組、病毒包裝和滴度測(cè)定利用DNA測(cè)序、基因重組等技術(shù)證實(shí)已成功構(gòu)建Tet-on可調(diào)控FTH1基因表達(dá)的慢病毒載體系統(tǒng),再進(jìn)行慢病毒包裝,得到病毒,檢測(cè)其滴度為1×109Tf U/ml。2攜載Tet-on可調(diào)控FTH1基因的慢病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染及篩選成功建立并篩選出轉(zhuǎn)染FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1),Western Blot檢測(cè)到FTH1基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)。3 MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞內(nèi)FTH1基因的可誘導(dǎo)表達(dá)及其聚鐵效應(yīng)Western Blot結(jié)果顯示,FTH1基因表達(dá)產(chǎn)物與誘導(dǎo)劑DOX存在量-濃度和量-時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。1μg/ml的DOX誘導(dǎo)3 d后,FTH1基因的表達(dá)產(chǎn)物量達(dá)到峰值。在完全培養(yǎng)基內(nèi)添加一定濃度DOX和枸櫞酸鐵銨時(shí),細(xì)胞可從周?chē)鷶z取鐵。3.0 T磁共振掃描顯示:MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞在T2WI信號(hào)明顯降低,對(duì)照組MSCs信號(hào)未見(jiàn)降低。普魯士藍(lán)染色和電鏡顯示:添加1μg/ml DOX和500μM FAC后,MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量鐵顆粒,而對(duì)照組僅見(jiàn)部分細(xì)胞內(nèi)有少許鐵顆粒。4 MSCs-Tet-FTH1成神經(jīng)誘導(dǎo)分化及鑒定MSCs在全反式維甲酸(ATRA)預(yù)誘導(dǎo)24 h,再用MNM成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化24 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,呈典型神經(jīng)元形態(tài),特異標(biāo)志物NSE、Nestin、MAP-2均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MSCs-Tet-FTH1經(jīng)相同方法誘導(dǎo)分化后亦檢測(cè)到上述變化。說(shuō)明轉(zhuǎn)染病毒對(duì)MSCs的誘導(dǎo)分化能力沒(méi)有明顯影響。5 MSCs-Tet-FTH1誘導(dǎo)分化后的FTH1基因表達(dá)及聚鐵能力MSCs-Tet-FTH1成神經(jīng)誘導(dǎo)分化后,Western Blot檢測(cè):Neurons-Tet-FTH1內(nèi)鐵蛋白仍有大量表達(dá),普魯士藍(lán)染色觀察到細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)色鐵染顆粒,透射電鏡亦檢測(cè)到有大量黑色致密顆粒。MRI顯示誘導(dǎo)分化后細(xì)胞仍能引起T2WI信號(hào)顯著降低。結(jié)論成功將含有FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞Neurons-Tet-FTH1,明確了成神經(jīng)誘導(dǎo)分化不影響MSCs細(xì)胞內(nèi)FTH1基因的表達(dá),基于FTH1的MRI報(bào)告基因成像可用于MSCs神經(jīng)分化后的檢測(cè),這將為干細(xì)胞治療提供一種可調(diào)控的、安全的、長(zhǎng)期的示蹤方法。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)誘導(dǎo)分化 報(bào)告基因FTH1 磁共振成像
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 前言15-17
• 1 材料和方法17-26
• 2 結(jié)果26-33
• 3 討論33-35
• 全文總結(jié)35-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 文獻(xiàn)綜述39-50
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 致謝50-51
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文51

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本文編號(hào)：729115