本文關(guān)鍵詞：大腸埃希氏菌植物分離株種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究

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【摘要】：研究背景與目的大腸桿菌常寄生在人和動(dòng)物的腸道中,在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下,也會(huì)伴隨糞便散布在周?chē)h(huán)境中。2006年9月美國(guó)“毒菠菜”事件和2011年5月德國(guó)腸出血性大腸桿菌O104:H4等一系列食用蔬菜所致疫情的暴發(fā)表明,植物很有可能攜帶致病性大腸桿菌,并成為繼人和動(dòng)物腸道后大腸桿菌的另一重要宿主。沙拉、大拌菜等生吃蔬菜的方式很流行,是民眾公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)健康餐。然而,如果人食用了被致病性大腸桿菌污染的蔬菜之后,健康將受到嚴(yán)重威脅。目前,關(guān)于大腸桿菌植物分離株的研究還比較匱乏,對(duì)于其在植物體內(nèi)持續(xù)生存的機(jī)制尚不清楚。全基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,為大腸桿菌種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究提供了空前機(jī)遇。本課題中,我們收集了上百株分離自植物內(nèi)部的大腸桿菌分離株,以分離自人和動(dòng)物的ECOR菌株為參照,對(duì)上述菌株進(jìn)行高通量測(cè)序,并對(duì)全基因組序列進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)分析,以期:(1)重建大腸桿菌植物分離株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;(2)從遺傳多樣性和基因組成角度,比較大腸桿菌植物分離株和人/動(dòng)物分離株ECOR的差異;(3)探討大腸桿菌在植物體內(nèi)生存的遺傳機(jī)制。研究?jī)?nèi)容與結(jié)果全基因組SNP變異及種群多樣性分析本研究中,我們對(duì)105株大腸桿菌植物分離株(GMB)和66株人/動(dòng)物分離株(ECOR)進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,并收集下載了64株NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的大腸桿菌完成圖序列。對(duì)共計(jì)256株菌進(jìn)行全基因組范圍SNP鑒定。經(jīng)組裝序列和測(cè)序reads雙重校驗(yàn),共得到354,888個(gè)可靠的SNP變異位點(diǎn)�；赟NP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,GMB菌株幾乎覆蓋了所有已知的基因型分群,與過(guò)去基于MLST的分析結(jié)果基本一致。結(jié)合核苷酸多樣性π值的計(jì)算,我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌植物分離株的遺傳多樣性超過(guò)了大腸桿菌全球分離株的代表集合—ECOR。其中,GMB菌株在大腸桿菌B1群的分布最廣泛,占全部GMB菌株的39.05%(41/105)。此外,我們發(fā)現(xiàn)GMB菌株存在兩個(gè)遺傳距離特別遠(yuǎn)的特有分支。根據(jù)平均核苷酸一致性(ANI)計(jì)算結(jié)果,可將其歸于類大腸桿菌分支C-I和C-V。GMB菌株采樣時(shí)間和采樣地點(diǎn)信息比較詳細(xì),為通過(guò)時(shí)間-空間分布規(guī)律研究大腸桿菌在自然環(huán)境中持續(xù)生存和傳播的模式提供了有力的背景資料。通過(guò)比較不同年份每個(gè)分離地點(diǎn)GMB菌株的組成情況,發(fā)現(xiàn)即便在同一農(nóng)場(chǎng),大腸桿菌種群組成在不同年份之間變化也很大(Fisher精確檢驗(yàn),P=0.0362)。GMB菌株兩兩之間的遺傳距離與采樣時(shí)間、地點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析表明,同一農(nóng)場(chǎng)不同年份的GMB菌株存在異質(zhì)性,提示大腸桿菌在植物中僅能當(dāng)年寄生,來(lái)年會(huì)發(fā)生種群更替現(xiàn)象;同時(shí),來(lái)自不同農(nóng)場(chǎng)但遺傳距離相當(dāng)近的GMB樣本只有少數(shù)幾對(duì),說(shuō)明同一年份大腸桿菌植物分離株跨地區(qū)傳播的現(xiàn)象較為少見(jiàn)。ECOR與GMB的種群進(jìn)化推動(dòng)力Tajima’s D中性檢驗(yàn)是推測(cè)DNA分子水平進(jìn)化歷程的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,可用于判斷隨機(jī)遺傳漂變、定向選擇、種群擴(kuò)增、瓶頸效應(yīng)、遺傳搭載等效應(yīng)。本研究利用GD軟件對(duì)66株ECOR菌株的143,865個(gè)變異位點(diǎn)和100株GMB菌株(不包括類分支C-V菌株)的185,854個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行Tajima’s D中性檢驗(yàn)。經(jīng)計(jì)算,得到ECOR和GMB種群的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量D值分別為0.448242和-0.151549,接近0,說(shuō)明ECOR和GMB菌株在種群水平上符合“中性突變的隨機(jī)漂變理論”。為探究ECOR和GMB兩個(gè)種群是否受宿主環(huán)境(動(dòng)物或植物)選擇壓力的影響,我們利用Ka Ks Caculator軟件的不同模型分別計(jì)算了兩個(gè)種群中各基因非同義/同義置換率的比值Ka/Ks。通過(guò)繪制箱線圖,發(fā)現(xiàn)GMB和ECOR兩個(gè)種群的Ka/Ks比值分布基本一致,但同時(shí)都存在異常值。通過(guò)多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,在這些異常值中鑒定出17個(gè)具有正向選擇信號(hào)的基因。其中5個(gè)出現(xiàn)在ECOR種群中,分別是maa、csg C、hyp A、hsr A和ybd J,前3個(gè)基因與大腸桿菌在宿主腸道內(nèi)的定植密切相關(guān),hsr A基因可能與耐藥性相關(guān);GMB種群中存在12個(gè)受正向選擇的基因位點(diǎn),其中bss S基因參與生物膜調(diào)控,dkg B、asr、blr和yib D基因分別與滲透壓刺激、酸休克和營(yíng)養(yǎng)饑餓等應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。該結(jié)果表明雖然大腸桿菌在種群水平以中性進(jìn)化為主,但在基因水平存在正向選擇,幫助不同種群的大腸桿菌適應(yīng)各自生存環(huán)境。與植物體內(nèi)生存相關(guān)的基因元件鑒定基因獲得缺失是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的重要手段。GMB菌株很可能會(huì)獲得一些特有基因元件,利于其在植物體內(nèi)生存。本研究利用BLAST和SOAP aligner等生物信息學(xué)序列比對(duì)軟件,對(duì)附屬基因組在測(cè)序樣本中的存在情況進(jìn)行解析,并與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)大腸桿菌附屬基因組片段的獲得缺失情況與其所在進(jìn)化分支密切相關(guān),但GMB整個(gè)種群不存在特異性的基因組片段。由于GMB菌株在B1群中分布最廣泛,我們將研究范圍聚焦在B1群,分析了B1群41株GMB菌株和19株ECOR菌株的附屬基因組獲得缺失情況。最終,鑒定出總長(zhǎng)度為105.73 Kbp的45個(gè)大片段,在至少5株GMB菌株中存在,而在19株ECOR菌株中均缺失。對(duì)鑒定的45個(gè)大片段進(jìn)行功能分類,主要鑒定出4類重要的功能:編碼DNA斷裂-重連蛋白和二氫葉酸還原酶,參與DNA損傷修復(fù)和維持細(xì)胞分裂時(shí)DNA含量的穩(wěn)定性;噬菌體相關(guān)蛋白,傳播毒力因子和耐藥性基因;Ara C家族蛋白,降解植物細(xì)胞壁,參與細(xì)菌和植物的相互作用;編碼精氨基琥珀酸合酶,參與精氨酸的生物合成通路,在氮饑餓狀態(tài)下提供氮源。其中,Ara C家族蛋白對(duì)于大腸桿菌從植物葉子表面進(jìn)入葉子內(nèi)部尋求相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境具有重要意義。此外,通過(guò)對(duì)獲得缺失熱圖的分析,我們發(fā)現(xiàn)三株分屬于不同進(jìn)化分支的GMB菌株擁有大量共同的附屬基因組片段。結(jié)合時(shí)空分布分析結(jié)果和菌株背景信息,我們推測(cè)GMB菌株雖然不是前一年大腸桿菌的直系后代,但他們可通過(guò)某種途徑(如土壤或噬菌體)獲得前一年菌株的基因組殘留物。研究結(jié)論與意義本研究首次從全基因組角度分析了植物體內(nèi)分離的大腸桿菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性,為認(rèn)識(shí)大腸桿菌在植物宿主中可能的生存及傳播機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)選擇壓力分析,分別鑒定出ECOR和GMB兩個(gè)種群受宿主環(huán)境選擇壓力影響的功能基因位點(diǎn),加深了對(duì)大腸桿菌適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。通過(guò)基因獲得缺失分析,發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌在植物體內(nèi)定植和毒力獲得相關(guān)的基因片段,初步探討了大腸桿菌在植物中生存并能引起人體致病的遺傳機(jī)制。同時(shí)發(fā)現(xiàn),盡管GMB菌株難以連年在同一局部區(qū)域增殖,但可以通過(guò)土壤等途徑遺留下基因組片段,并被新的替換種群所獲取。這為致病、耐藥等基因的水平轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。因此,加強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤環(huán)境監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)并切斷這一新的潛在傳播途徑,將有助于致病大腸桿菌相關(guān)疫情的預(yù)防和控制工作。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 植物 全基因組測(cè)序 種群結(jié)構(gòu) 群體基因組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;R378
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-18
• 第一章 菌株采集與全基因組測(cè)序18-21
• 1 菌株收集及背景信息18-19
• 2 全基因組測(cè)序、組裝以及基因預(yù)測(cè)和功能注釋19-20
• 3 小結(jié)與討論20-21
• 第二章 全基因組SNP變異及種群多樣性分析21-31
• 1 單核苷酸變異分析21-23
• 1.1 SNP鑒定策略21-22
• 1.2 SNP鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)22-23
• 2 種群結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性23-28
• 2.1 256 株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析23-25
• 2.2 不同種群核苷酸多樣性計(jì)算25-26
• 2.3 新發(fā)現(xiàn)兩個(gè)類大腸桿菌分支26-28
• 3 GMB菌株的時(shí)空分布規(guī)律28-30
• 3.1 不同年份每個(gè)分離地點(diǎn)GMB的組成28-29
• 3.2 遺傳距離與采樣地點(diǎn)和采樣時(shí)間之間的關(guān)系29-30
• 4 小結(jié)與討論30-31
• 第三章 ECOR和GMB的種群進(jìn)化推動(dòng)力31-40
• 1 Tajima’s D中性檢驗(yàn)31-32
• 1.1 Tajima’s D簡(jiǎn)介與計(jì)算方法31
• 1.2 Tajima’s D分析結(jié)果31-32
• 2 選擇壓力分析及正向選擇檢測(cè)32-38
• 2.1 Ka/Ks簡(jiǎn)介與計(jì)算方法32-33
• 2.2 ECOR和GMB兩種群正向選擇檢測(cè)33-36
• 2.3 受正向選擇作用基因的功能分析36-38
• 3 小結(jié)與討論38-40
• 第四章 與植物體內(nèi)生存相關(guān)的基因元件鑒定40-47
• 1 基因組片段獲得缺失鑒定策略40-41
• 2 附屬基因組在測(cè)序樣本中的存在缺失情況41-42
• 3 基因型B1群GMB菌株片段獲得缺失分析42-45
• 4 小結(jié)與討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 附錄52-73
• 附錄1 GMB菌株的采樣信息52-56
• 附錄2 測(cè)序樣本的組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)信息56-62
• 附錄3 各分支代表株與Y1/Y2分支菌株的ANI計(jì)算結(jié)果62-63
• 附錄4 類分支/其他埃希氏菌屬與Y1/Y2分支菌株ANI計(jì)算結(jié)果63-64
• 附錄5 ECOR和GMB種群Ka/Ks異常值64-71
• 附錄6 植物體內(nèi)生存相關(guān)基因元件BLAST比對(duì)結(jié)果71-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷73-74
• 致謝74

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