本文關(guān)鍵詞：B型流感病毒反向遺傳平臺(tái)的構(gòu)建及其應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： B型流感病毒 生長(zhǎng)特性 系間重配 反向遺傳

【摘要】：研究目的：構(gòu)建B型流感病毒反向遺傳技術(shù)平臺(tái),并利用該反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建B型流感重配病毒,研究影響病毒生長(zhǎng)特性的因素。研究方法：利用A型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)pHW2000載體為骨架,構(gòu)建B型流感病毒反向遺傳平臺(tái),即構(gòu)建包含病毒各節(jié)段的8個(gè)重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)�；旌虾蠊厕D(zhuǎn)染293T及MDCK混合細(xì)胞,培養(yǎng)后以雞胚或細(xì)胞傳代拯救B型流感病毒重配病毒；根據(jù)病毒基因組序列特點(diǎn),挑選2013-2015年間我國(guó)分離的B型野生型及系間重配流感病毒作為研究對(duì)象,利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose,簡(jiǎn)稱TCID50)方法計(jì)算病毒液含有的顆粒數(shù),稀釋病毒液至顆粒數(shù)相同后再感染MDCK細(xì)胞,收集各時(shí)間點(diǎn)的病毒培養(yǎng)液,進(jìn)行病毒滴定,以培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo),各時(shí)間點(diǎn)下病毒滴度為縱坐標(biāo),獲得病毒生長(zhǎng)曲線；檢測(cè)病毒神經(jīng)氨酸酶活性,并以酶活動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值表示；嘗試?yán)脴?gòu)建的B型流感反向遺傳系統(tǒng),拯救不同組合的重配B型流感病毒,測(cè)定重配病毒的生長(zhǎng)特性,分析影響病毒生長(zhǎng)特性的因素。主要結(jié)果：成功構(gòu)建了B型流感病毒反向遺傳技術(shù)平臺(tái)并加以應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)2013-2015年我國(guó)分離的野生型病毒及系間重配病毒的生長(zhǎng)曲線走勢(shì)相似,在感染后的0-48h病毒滴度不斷上升,可維持至72h后病毒滴度逐漸下降,病毒的Km值分布于16-40之間；利用該B型流感病毒技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建了不同片段替換方式的重配病毒,對(duì)重配病毒進(jìn)行生長(zhǎng)曲線檢測(cè),結(jié)果顯示單一替換基因片段對(duì)病毒的生長(zhǎng)特性無(wú)顯著影響,而三種多片段組合替換方式均可導(dǎo)致重配病毒生長(zhǎng)特性降低。結(jié)論：利用A型流感病毒pHW2000為載體的反向遺傳技術(shù)同樣適用于B型流感病毒,并可利用該系統(tǒng)構(gòu)建B型重配流感病毒以驗(yàn)證影響病毒生長(zhǎng)特性的主要因素；多基因協(xié)同作用影響B(tài)型流感病毒的生長(zhǎng)特性。
【關(guān)鍵詞】：B型流感病毒 生長(zhǎng)特性 系間重配 反向遺傳
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373.13
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 構(gòu)建B型流感病毒反向遺傳技術(shù)平臺(tái)12-32
• 1 材料與耗材12-15
• 1.1 細(xì)胞12
• 1.2 雞胚12
• 1.3 病毒12
• 1.4 主要試劑與配制方法12-13
• 1.5 主要耗材13-14
• 1.6 主要儀器14-15
• 2 方法15-27
• 2.1 病毒核酸提取15
• 2.2 目的片段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)15-17
• 2.3 瓊脂糖凝膠電泳17
• 2.4 產(chǎn)物回收實(shí)驗(yàn)17-19
• 2.5 BsmBI限制性內(nèi)切酶酶切體系19
• 2.6 載體連接實(shí)驗(yàn)19-20
• 2.7 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)20-22
• 2.8 質(zhì)粒提取22-23
• 2.9 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)23-27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 目的片段獲得及基因序列分析27-28
• 3.2 質(zhì)粒構(gòu)建28-29
• 3.3 拯救病毒及重配病毒鑒定29
• 4 討論29-32
• 第二部分 利用反向遺傳平臺(tái)構(gòu)建重配病毒并對(duì)重配病毒進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究32-51
• 1 材料與耗材32-33
• 1.1 細(xì)胞32
• 1.2 雞胚32
• 1.3 病毒32
• 1.4 主要試劑與配制方法32-33
• 1.5 主要耗材33
• 1.6 主要儀器33
• 2 方法33-39
• 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代33
• 2.2 病毒細(xì)胞傳代33
• 2.3 病毒雞胚傳代方法33-34
• 2.4 神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)34-36
• 2.5 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID_(50))實(shí)驗(yàn)36-38
• 2.6 病毒生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.7 拯救重配病毒39
• 3 結(jié)果39-48
• 3.1 病毒進(jìn)化分析39-40
• 3.2 病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定40-43
• 3.3 神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)果43-44
• 3.4 系間重配病毒的片段替換44-48
• 4 討論48-51
• 第三部分 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 綜述54-60
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 致謝60-62
• 附錄 已發(fā)表文章全文62-66

【相似文獻(xiàn)】

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