本文關(guān)鍵詞：全人源抗IL-33scFv-IgG1Fc融合蛋白在CHO k1細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)

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【摘要】：目的利用兩種不同真核表達(dá)載體構(gòu)建全人源抗白細(xì)胞介素33單鏈抗體c片段(IL-33 sc Fv-Fc)重組載體,轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)k1細(xì)胞,篩選穩(wěn)定高表達(dá)單細(xì)胞株以提高融合蛋白產(chǎn)量。方法雙酶切前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pc DNA3.1/SPsc Fv-Fc,回收SP-sc Fv-Fc片段,插入載體PMH3EN中,構(gòu)建PMH3EN/SP-sc Fv-Fc重組載體并與重組質(zhì)粒pc DNA3.1/SP-sc Fv-Fc分別轉(zhuǎn)染CHO k1細(xì)胞;反轉(zhuǎn)錄PCR、Western blot法檢測目的基因sc Fv-Fc的轉(zhuǎn)錄及表達(dá);Dot blot法篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株;ELISA檢測sc Fv-Fc的水平及生物學(xué)活性。結(jié)果重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PMH3EN/SP-sc Fv-Fc,插入目的基因SP-sc Fv-Fc大小為1560 bp左右。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測重組質(zhì)粒表達(dá)情況顯示兩組重組質(zhì)粒的目的基因在CHO k1細(xì)胞中均成功轉(zhuǎn)錄。sc Fv-Fc不僅可分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中,還可與人IL-33以及抗人Ig G1 Fc特異性結(jié)合。重組載體PMH3EN/SP-sc Fv-Fc組融合蛋白表達(dá)水平相對較高。經(jīng)過4輪篩選,選出了穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株,初步測其sc Fv-Fc表達(dá)產(chǎn)量為10 mg/L;競爭ELISA檢測結(jié)果顯示sc Fv-Fc可顯著抑制IL-33與其受體ST2的結(jié)合。結(jié)論在CHO k1細(xì)胞成功高表達(dá)IL-33 sc Fv-Fc。
【作者單位】： 四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 白細(xì)胞介素 單鏈抗體c片段(sc Fv-Fc) CHO k細(xì)胞 表達(dá)載體
【基金】：四川省科技廳項(xiàng)目(2015JY0218,LY96) 四川省教育廳項(xiàng)目(14ZB0158)
【分類號】：R329.2
【正文快照】： 白細(xì)胞介素33(interleukin 33,IL-33)是IL-1家族成員,廣泛表達(dá)于多種組織與細(xì)胞[1],主要參與調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞型免疫反應(yīng),與過敏性疾病、自身免疫性疾病有明顯的相關(guān)性。用IL-33抗體抑制IL-33/ST2通路,可以減輕小鼠過敏性哮喘、過敏性鼻炎以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀,抑制病情發(fā)展[2-4]，

本文編號：680049