本文關(guān)鍵詞：采用酵母雙雜交技術(shù)篩選抗人CXCR4的單鏈抗體及其初步分析研究

  更多相關(guān)文章： CXCR4 酵母雙雜交技術(shù) 單鏈抗體 癌癥 蛋白純化

【摘要】：目的:趨化因子受體4(CXCR4)的大小約40 kDa,是一種跨膜糖蛋白,是腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記物。近年來研究發(fā)現(xiàn)CXCR4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。本文利用酵母雙雜交技術(shù)從單鏈抗體文庫中篩選抗CXCR4的單鏈抗體,將篩選的單鏈抗體進(jìn)行蛋白純化,為研究這些單鏈抗體在體內(nèi)外的抗腫瘤活性奠定基礎(chǔ)。方法:首先構(gòu)建酵母雙雜交體系中的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4,將其轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109內(nèi),在含有營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基中檢測其自激活。將單鏈抗體文庫轉(zhuǎn)化到含有誘餌質(zhì)粒的AH109內(nèi),并在SD/-Trp/-leu/-His+10mM3-AT培養(yǎng)板上對抗體文庫進(jìn)行篩選。將生長的候選陽性克隆在SD/-Trp/-leu/-His/-Ade+10mM3-AT培養(yǎng)板上進(jìn)行劃線篩選,將篩選的克隆分別回轉(zhuǎn)到含有對照載體pGBKT7、含有對應(yīng)抗原pGBKT7-CXCR4、以及含有無關(guān)抗原的AH109內(nèi)。經(jīng)過篩選,將最終得到的陽性克隆進(jìn)行DNA測序及其分析。將單鏈抗體基因克隆到表達(dá)載體pET-28a-sumo內(nèi),將其轉(zhuǎn)化到BL21菌體中進(jìn)行包涵體蛋白純化。采用ELISA技術(shù)檢測純化后的單鏈抗體與抗原CXCR4的結(jié)合能力。結(jié)果:(1)構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4沒有自激活作用。(2)采用CXCR4作為抗原篩選單鏈抗體文庫,利用酵母雙雜交技術(shù)最終篩選得到3個陽性單鏈抗體克隆,經(jīng)過DNA序列分析確定為3個人的單鏈抗體,分別為aCX73、aCX82、aCX136。(3)將3個單鏈抗體基因克隆到表達(dá)載體pET-28a-sumo內(nèi),將其轉(zhuǎn)化到BL21菌體內(nèi)進(jìn)行包涵體純化,成功地純化了其中2個單鏈抗體(aCX73、aCX82)。(4)采用ELISA檢測表明:這2個單鏈抗體和抗原CXCR4具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,可以用于將來的抗癌實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)論:應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從單鏈抗體文庫中篩選到了抗CXCR4的單鏈抗體a CX73、aCX82、aCX136,純化的aCX73、aCX82與抗原CXCR具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,為將來一步研究這些單鏈抗體在體內(nèi)外抗癌的研究奠定了較好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CXCR4 酵母雙雜交技術(shù) 單鏈抗體 癌癥 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-21
• 1.1 CXCR4的概述8-13
• 1.1.1 CXCR4和CXCL12的結(jié)構(gòu)及功能8-9
• 1.1.2 CXCR4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況9-10
• 1.1.3 CXCR4對腫瘤的作用10-13
• 1.1.4 CXCR4對腫瘤治療的作用13
• 1.2 腫瘤干細(xì)胞的概念及特性13-15
• 1.2.1 腫瘤干細(xì)胞的來源13-14
• 1.2.2 腫瘤干細(xì)胞的特征14-15
• 1.3 單鏈抗體的概述15-17
• 1.3.1 單鏈抗體的表達(dá)方式15-16
• 1.3.2 單鏈抗體在治療腫瘤上的應(yīng)用16-17
• 1.4 酵母雙雜交體系17-19
• 1.4.1 酵母雙雜交的基本原理17
• 1.4.2 酵母雙雜交的應(yīng)用17-18
• 1.4.3 酵母雙雜交的優(yōu)缺點(diǎn)18-19
• 1.5 選題的目的、意義19-20
• 1.6 技術(shù)路線20-21
• 第二章 材料與方法21-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.1.3 細(xì)菌及質(zhì)粒23-24
• 2.1.4 主要溶液24-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-40
• 2.2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4的構(gòu)建28-29
• 2.2.2 將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4轉(zhuǎn)化到酵母AH109內(nèi)及其自激活檢測29-31
• 2.2.3 單鏈抗體文庫的篩選31
• 2.2.4 候選陽性克隆的劃線篩選31
• 2.2.5 將候選陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證31-33
• 2.2.6 陽性克隆的DNA序列分析33
• 2.2.7 含有單鏈抗體基因的表達(dá)載體的構(gòu)建33-36
• 2.2.8 單鏈抗體的表達(dá)純化36-39
• 2.2.9 采用ELISA檢測單鏈抗體與抗原CXCR4的結(jié)合39-40
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-51
• 3.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4測序鑒定40
• 3.2 AH109表型鑒定40-41
• 3.3 檢測誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4的自激活作用41
• 3.4 單鏈抗體文庫的篩選41-42
• 3.5 候選陽性克隆的劃線篩選42-43
• 3.6 候選陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證43-46
• 3.7 陽性克隆的DNA序列分析46
• 3.8 含有單鏈抗體基因的表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 3.9 單鏈抗體的包涵體純化47-50
• 3.9.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化47-48
• 3.9.2 采用WB驗(yàn)證單鏈抗體48
• 3.9.3 單鏈抗體的包涵體純化48-50
• 3.10 檢測單鏈抗體與抗原CXCR4的結(jié)合50-51
• 第四章 討論51-54
• 4.1 抗原CXCR4的選擇51
• 4.2 酵母雙雜交技術(shù)的選擇51-52
• 4.3 假陽性的排除52
• 4.4 陽性克隆的DNA序列分析以及單鏈抗體的表達(dá)純化52-53
• 4.5 檢測單鏈抗體與抗原CXCR4的結(jié)合53-54
• 第五章 結(jié)論和展望54-56
• 5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：54-55
• 5.1.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CXCR4的鑒定54
• 5.1.2 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選抗CXCR4的單鏈抗體及初步分析54
• 5.1.3 陽性克隆的DNA序列分析、表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)純化54
• 5.1.4 單鏈抗體與抗原CXCR4的結(jié)合54-55
• 5.2 實(shí)驗(yàn)展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 在學(xué)期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63

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本文編號：678049