本文關(guān)鍵詞：脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO家族與脂毒關(guān)系研究

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【摘要】：當(dāng)長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累超過脂肪組織的儲(chǔ)存能力，會(huì)在非脂肪組織過度沉積，造成脂毒，進(jìn)而引發(fā)脂毒性凋亡，是多種代謝性疾病的主要病因。脂肪酸延長(zhǎng)酶家族參與脂肪酸代謝流，且與膜脂的代謝密切相關(guān)。但脂肪酸延長(zhǎng)酶與脂毒關(guān)系并不清楚。酵母脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO家族包括Elo1、Elo2、Elo3，其中Elo2和Elo3負(fù)責(zé)將長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)到極長(zhǎng)鏈脂肪酸，并參與細(xì)胞多項(xiàng)生命活動(dòng)和功能的調(diào)節(jié)，在真核生物中有很高的保守性，因此選擇酵母研究相關(guān)機(jī)制是很好的模型。 本文首先建立了油紅O比色快速檢測(cè)酵母中性脂含量的方法。利用油紅O比色法和薄層層析法分析野生型BY4741和脂肪酸延長(zhǎng)酶缺陷菌株脂質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)elo缺陷菌株中性脂含量積累。油酸處理后，胞內(nèi)中性脂含量升高。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析脂肪酸組成，結(jié)果顯示ELO3敲除后，C26脂肪酸基本檢測(cè)不到，而C20與C22脂肪酸會(huì)累積；ELO2缺失后，C26脂肪酸的含量也明顯降低。而油酸的處理會(huì)增加BY4741胞內(nèi)總的極長(zhǎng)鏈脂肪酸的比例。油酸處理后，elo2△和elo3△的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例增大。 極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO2和ELO3缺陷后，細(xì)胞對(duì)油酸高度敏感。而ELO1突變株無油酸敏感表型。同時(shí)加入抗氧化劑VC或NAC，能有效補(bǔ)救油酸造成突變株的生長(zhǎng)抑制。利用DCFH-DA檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平，顯示油酸處理后elo2△和elo3△胞內(nèi)ROS含量積累。接下來對(duì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化劑含量的進(jìn)行測(cè)定，顯示油酸處理后野生型及elo1△胞內(nèi)抗氧化酶活性升高，而elo2△和elo3△胞內(nèi)的CAT和SOD酶活性急劇降低；油酸處理后，還原型谷胱甘肽GSH含量均降低。通過對(duì)胞內(nèi)MDA及PCO含量的測(cè)定，顯示油酸處理后其含量均升高，表明油酸對(duì)酵母細(xì)胞造成了氧化損傷。尤其是elo2△和elo3△胞內(nèi)MDA含量的升高有極顯著性差異。elo2△和elo3△對(duì)兩性霉素B等抗生素具有高度敏感性。對(duì)其麥角固醇含量的檢測(cè)，顯示含量低于野生型酵母菌株。利用PI染色檢測(cè)細(xì)胞膜的通透性，發(fā)現(xiàn)elo2△和elo3△的膜通透性明顯高于野生型細(xì)胞，且油酸處理后膜通透性顯著提高。結(jié)果表明極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶的缺失不僅引起細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成的變化，抗油酸誘導(dǎo)的氧化能力下降，同時(shí)還導(dǎo)致膜脂麥角固醇含量降低，，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降。 通過構(gòu)建elo3△背景的酵母必需基因超表達(dá)文庫(kù)，在高濃度油酸培養(yǎng)基上篩選抵抗油酸脅迫的菌株。經(jīng)過質(zhì)粒測(cè)序得到一系列油酸響應(yīng)基因，包括復(fù)制起始因子，參與復(fù)制修復(fù)、mRNA剪接的亞基，參與泛素化降解的ATP酶，及參與合成血紅素A的鐵氧還蛋白等。篩選結(jié)果證實(shí)了氧化應(yīng)激在脂毒性中的重要作用。同時(shí)，表明極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶對(duì)維護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，抵抗油酸脅是不可缺少的。進(jìn)一步對(duì)這些抗性基因進(jìn)行功能研究，將會(huì)更加深入地了解脂毒機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：脂肪酸延長(zhǎng)酶 脂代謝 脂毒性 氧化脅迫
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411;Q55
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目錄9-11
• 縮略語11-12
• 1 緒論12-18
• 1.1 脂毒性及其機(jī)制研究進(jìn)展12-16
• 1.2 脂肪酸延長(zhǎng)酶的研究進(jìn)展16-18
• 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案18-20
• 2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁饬x18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容18-19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)流程圖19-20
• 3 酵母中性脂快速檢測(cè)及積累動(dòng)態(tài)分析20-29
• 3.1 材料與試劑20-22
• 3.2 方法22-23
• 3.3 結(jié)果23-27
• 3.4 討論27-29
• 4 ELO 家族與脂代謝的關(guān)系29-47
• 4.1 材料與試劑29-30
• 4.2 方法30-36
• 4.3 結(jié)果36-46
• 4.4 討論46-47
• 5 脂毒性脅迫機(jī)制47-66
• 5.1 材料與試劑47-49
• 5.2 方法49-56
• 5.3 結(jié)果56-64
• 5.4 討論64-66
• 6 抗油酸脅迫基因的篩選66-74
• 6.1 材料與試劑66-67
• 6.2 方法67-69
• 6.3 結(jié)果69-73
• 6.4 討論73-74
• 總結(jié)74-76
• 參考文獻(xiàn)76-83
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果83-84
• 致謝84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 ;蝸牛酶的制備和對(duì)酵母細(xì)胞壁的作用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1978年06期

2 林汝榕;邢炳鵬;蔡文旋;柯秀蓉;林錫煌;;蘇丹黑B染色處理細(xì)胞技術(shù)在快速檢測(cè)微藻油脂含量中的應(yīng)用[J];臺(tái)灣海峽;2011年02期

本文編號(hào)：669921