發(fā)布時間：2017-08-10 03:22

  本文關(guān)鍵詞：人源抗TLR4抗體IgG的制備及其中和作用機制

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【摘要】：TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族的成員之一,是脂多糖(lipopolysacc-haride,LPS)的模式識別受體。脂多糖是細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin)的主要成分,是革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁的成分[1,2]。內(nèi)毒素有多種生物活性,進(jìn)入人體血液可造成內(nèi)毒素血癥(endotoxemia,ETM),可引起多種病理生理過程變化如發(fā)熱、休克、彌漫性血管內(nèi)凝血和粒細(xì)胞減少等,甚至造成嚴(yán)重后果如呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome,ARDS),急性腎衰竭(acute renal failure,ARF),甚至多器官功能衰竭等多種疾病,最終可因內(nèi)毒素休克死亡[3,4]。TLR4廣泛表達(dá)在免疫細(xì)胞表面,其中既包括非特異免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞,又包括介導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞[5]。LPS在細(xì)胞外被識別后導(dǎo)致TLR4受體寡聚化激活,將LPS刺激信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過MyD88依賴和非MyD88依賴的兩條途徑觸發(fā)一系列的信號激聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)NF-κB、AP-1和IRF-3等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和核轉(zhuǎn)位[6],上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá),最后啟動炎癥反應(yīng)[7,8]。TLR4在內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起極其重要的作用,是內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵點和內(nèi)毒素瀑布效應(yīng)的限速步驟,是整個內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐。阻斷TLR4對內(nèi)毒素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),是控制內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)最為有效的手段。在先期實驗中,本課題組已從庫容為5.76×109的全人源Fab抗體庫中篩選出多株高結(jié)合活力抗TLR4 Fab,其中克隆株TLR4L4表現(xiàn)出較高的中和活性。本研究通過基因工程技術(shù)和抗體工程技術(shù),制備和表達(dá)具有中和活性的全分子人源抗TLR4 IgG,并對表達(dá)純化獲得的抗體進(jìn)行功能鑒定,初步探究其作用機制,為進(jìn)一步探討其在炎癥治療中的作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.重組抗tlr4抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建將抗tlr4lfab可變區(qū)序列與人類抗體基因組序列數(shù)據(jù)庫(http://www.imgt.org/)進(jìn)行比對,根據(jù)同源性,修復(fù)該抗體核酸序列fr1起始處及fr4結(jié)尾處的基因突變。根據(jù)infusionpcr原理設(shè)計抗tlr4抗體的重、輕鏈pcr擴增引物,分別使用限制性內(nèi)切酶切消化抗體真核表達(dá)載體pfuse-chig-hg1、pfuse-clig-hl。該兩種質(zhì)粒分別包含igg1型人源重鏈和輕鏈(lambda)恒定區(qū)基因序列。以tlr4lfab為模板,使用設(shè)計合成的if引物擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列,將抗體可變區(qū)基因pcr產(chǎn)物克隆到抗體真核表達(dá)質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后,篩選陽性克隆并酶切鑒定,對酶切鑒定正確的克隆測序以確認(rèn)序列連接正確。2.抗tlr4全分子igg的表達(dá)和純化將測序正確的pfuse-chig-hg1-tlr4l4h和250μlpfuse-clig-hl-tlr4l4k重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293freestyle(293f)細(xì)胞中,將細(xì)胞放在co2搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng),120小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。過濾后使用蛋白純化系統(tǒng)和hitrapproteina預(yù)裝柱,按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟純化。純化后使用30kd超濾離心管置換抗體緩沖液并濃縮,使用0.22μm濾膜過濾分裝保存。3.抗tlr4igg免疫學(xué)特性分析分別使用酶聯(lián)免疫吸附實驗、免疫共沉淀、質(zhì)譜檢測、親和力檢測等對抗tlr4igg的結(jié)合性,親和力進(jìn)行特性檢測分析。4.抗tlr4igg中和作用及機制初步分析建立pma-lps-thp-1炎癥細(xì)胞模型,檢測抗體對thp-1細(xì)胞tnf-α蛋白表達(dá)水平變化。通過免疫熒光、westernblot等實驗檢測抗tlr4igg作用前后,thp-1細(xì)胞表面md-2和cd14的表達(dá)水平變化。結(jié)果:1.抗tlr4抗體igg真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定采用pcr分別擴增出長度389bp的vh基因和325bp的vl基因,通過序列比對、設(shè)計引物及酶切載體,經(jīng)infusionpcr獲得pfuse-chig-hg1-tlr4l4h和250μlpfuse-clig-hl-tlr4l4k質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后測序正確。2.抗TLR4抗體IgG表達(dá)、純化使用293 Free style Expression System真核表達(dá)抗TLR4 IgG,經(jīng)檢測,該系統(tǒng)表達(dá)全分子抗體,得率高,約6mg/100ml,純度較好。SDS-PAGE結(jié)果顯示,純化后的抗體在55kD和25kD左右分別有一條帶,分別為抗TLR4 IgG的重鏈和輕鏈。3.抗TLR4 IgG特性分析ELISA顯示抗TLR4 IgG與重組TLR4蛋白可特異性結(jié)合,并具有較好的量效關(guān)系。免疫沉淀實驗證實抗TLR4 IgG能特異性結(jié)合TLR4蛋白,將SDS-PAGE檢測的75kDa處的蛋白條帶送質(zhì)譜檢測分析,結(jié)果顯示該抗體結(jié)合的蛋白為TLR4。親和力檢測,抗TLR4 IgG的親和力KD為7.380×10-10。4.抗TLR4 IgG中和作用及機制分析細(xì)胞學(xué)實驗表明隨著抗TLR4抗體濃度的增加,抗體對THP-1細(xì)胞TNF-α蛋白的表達(dá)具有明顯抑制作用。Western Blot和免疫熒光顯示抗TLR4 IgG作用于THP-1細(xì)胞之后,可明顯抑制MD-2表達(dá),而CD14的表達(dá)沒有明顯變化,表明抗TLR4 IgG抑制TLR4信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制可能與MD-2相關(guān),與CD14無明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建了全人源抗TLR4抗體的真核表達(dá)載體,表達(dá)并純化后的全分子抗TLR4 IgG具有較好的生物學(xué)活性。2.初步證明本研究制備的抗TLR4 IgG具有一定的中和作用,其作用機制與抑制MD-2的表達(dá)相關(guān),與CD14無明顯相關(guān)性,對TLR4相關(guān)炎癥性疾病治療具有潛在的應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體4 全人源抗體 中和抗體 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-16
• 第一部分 全人源抗TLR4全分子IgG的表達(dá)與純化16-29
• 摘要16
• 1 材料與方法16-25
• 2 結(jié)果25-27
• 3 討論27-29
• 第二部分 全人源抗TLR4 IgG特性鑒定及作用機制29-43
• 摘要29
• 1 材料與方法29-36
• 2 結(jié)果36-41
• 3.討論41-43
• 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 綜述47-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 附錄59-60
• 致謝60

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本文編號：648620