本文關(guān)鍵詞：單增李斯特菌在群體感應(yīng)抑制劑作用下的生物學(xué)特性研究及其快速檢測技術(shù)的開發(fā)

  更多相關(guān)文章： 單增李斯特菌 群體感應(yīng)抑制劑 3 4-二溴-2(5H)-呋喃酮 6-氨青霉素烷酸 p60蛋白 免疫磁珠-酶聯(lián)免疫

【摘要】：單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),簡稱單增李斯特菌,是一種常見的食源性致病菌,極易在食品或加工環(huán)境中殘留,從而引起各種動物源性冷藏食品安全問題。因此,為了有效預(yù)防控制LM的感染,提高LM檢測效率,本文初步探究了群體感應(yīng)抑制劑對LM菌落生長、生物膜形成以及LM侵染細(xì)胞的影響,并建立一種快速高效檢測LM方法。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:(1)通過測定菌落生長曲線、細(xì)菌總蛋白含量、胞外多糖含量變化規(guī)律,并通過結(jié)晶紫染色法及掃描電鏡觀察生物膜形態(tài),研究群體感應(yīng)抑制劑3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮和6-氨青霉素烷酸對LM生物學(xué)特性的影響等。結(jié)果表明,3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮對LM的最小抑菌濃度(MIC)為25μg/mL,最低致死劑量(MBC)為400μg/mL;6-氨青霉素烷酸對LM的MIC為3.12μg/mL,MBC為100μg/mL。兩種群體感應(yīng)抑制劑在一定的工作濃度下,對LM的菌落的生長及生物膜形成均有著一定的調(diào)控作用,且隨著抑制劑濃度的增加,調(diào)控作用逐漸增強(qiáng)。(2)通過MTT檢測、乳酸脫氫酶含量檢測、細(xì)菌黏附率檢測等實(shí)驗(yàn),研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮和6-氨青霉素烷酸分別在MIC,5MIC,10MIC濃度下,對LM侵染細(xì)胞的影響。當(dāng)3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮濃度分別為MIC,5MIC,10MIC時,其對LM侵染Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生了一定的影響,黏附率抑制率分別為44.41%,67.68%和85.28;而在6-氨青霉素烷酸作用下,最終的黏附抑制率分別為12.17%,59.60%和76.51%。結(jié)果表明:LM與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)時,兩種抑制劑均對LM黏附Caco-2細(xì)胞有著明顯的抑制作用,且隨著抑制劑濃度的增加,抑制作用也逐漸增強(qiáng)。(3)將LM毒力基因iap經(jīng)過原核克隆與表達(dá),得到的表達(dá)產(chǎn)物p60蛋白作為免疫原免疫動物制備多克隆抗體,通過抗體與磁珠的偶聯(lián)獲得抗LM免疫磁珠,建立一種免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫快速檢測LM方法。結(jié)果表明:建立的免疫磁珠-酶聯(lián)免疫法,靈敏性為1.2×10~5 cfu/mL,最低檢測限為31cfu/mL,其板內(nèi)變異系數(shù)平均為3.14%,板間變異系數(shù)為2.69%,與熒光假單胞菌、大腸桿菌、糞腸球菌交叉反應(yīng)率均小于0.1%,對樣品的平均加標(biāo)回收率為96.4%。滿足LM的檢測需要。
【關(guān)鍵詞】：單增李斯特菌 群體感應(yīng)抑制劑 3 4-二溴-2(5H)-呋喃酮 6-氨青霉素烷酸 p60蛋白 免疫磁珠-酶聯(lián)免疫
【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 緒論15-25
• 1.1 概述15
• 1.2 LM的生物學(xué)特性15
• 1.3 LM的危害15-16
• 1.4 LM的致病機(jī)理16-20
• 1.4.1 毒力因子16-18
• 1.4.2 生物膜18-19
• 1.4.3 群體感應(yīng)19-20
• 1.4.4 侵染細(xì)胞的能力20
• 1.5 LM的檢測技術(shù)20-24
• 1.5.1 傳統(tǒng)分離檢測技術(shù)20-21
• 1.5.2 PCR檢測技術(shù)21-22
• 1.5.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)22
• 1.5.4 膠體金免疫層析檢測技術(shù)22
• 1.5.5 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)22-24
• 1.6 主要研究內(nèi)容及研究意義24-25
• 2 群體感應(yīng)抑制劑對單增李斯特菌菌落生長及生物膜形成的影響25-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑26
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.2.1 測定QSI最小抑菌濃度及最低致死劑量26-27
• 2.2.2 QSI對LM菌落生長的影響27
• 2.2.3 QSI對LM總蛋白及胞外多糖含量的影響27-28
• 2.2.4 QSI與抗生素抑菌效果的比較28
• 2.2.5 QSI對LM生物膜形成的影響28-30
• 2.3 結(jié)果與討論30-41
• 2.3.1 MIC和MBC的確定30
• 2.3.2 LM生長曲線的測定30-31
• 2.3.3 LM總蛋白及多糖含量變化曲線的測定31-34
• 2.3.4 QSI與抗生素抑菌效果的比較34-36
• 2.3.5 QSI作用下LM生物膜形成的研究36-41
• 2.4 本章小結(jié)41-43
• 3 群體感應(yīng)抑制劑對單增李斯特菌侵染細(xì)胞的影響43-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞43
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要耗材43-44
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 3.2.1 單增李斯特菌的增菌培養(yǎng)44
• 3.2.2 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)44-45
• 3.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)45
• 3.2.4 乳酸脫氫酶活性測定45-46
• 3.2.5 細(xì)菌黏附性測定46
• 3.3 結(jié)果與討論46-49
• 3.3.1 MTT檢測細(xì)胞增殖毒性46-47
• 3.3.2 乳酸脫氫酶活性測定47-48
• 3.3.3 QSI作用下LM黏附率的測定48-49
• 3.4 本章小結(jié)49-50
• 4 單增李斯特菌多克隆抗體的制備及快速檢測方法的建立50-69
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 4.1.1 主要菌種和實(shí)驗(yàn)動物50
• 4.1.2 主要試劑50-51
• 4.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法51-60
• 4.2.1 主要緩沖液的配制51-54
• 4.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備54
• 4.2.3 iap基因的擴(kuò)增54-55
• 4.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定55
• 4.2.5 重組蛋白p60的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定55-57
• 4.2.6 多克隆抗體的制備57
• 4.2.7 抗血清效價的測定57-58
• 4.2.8 多克隆抗體的純化及其與磁珠的偶聯(lián)58
• 4.2.9 最佳工作濃度的確定58-59
• 4.2.10 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立59
• 4.2.11 ELISA方法的特異性檢測59-60
• 4.2.12 ELISA方法的重復(fù)性檢測60
• 4.2.13 加標(biāo)回收率的測定60
• 4.3 結(jié)果與討論60-68
• 4.3.1 iap基因的擴(kuò)增60-62
• 4.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定62-63
• 4.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的特異性鑒定63-64
• 4.3.4 抗血清效價的測定64
• 4.3.5 最佳工作濃度的確定64-65
• 4.3.6 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立65-66
• 4.3.7 ELISA方法的特異性檢測66
• 4.3.8 ELISA方法的重復(fù)性檢測66-67
• 4.3.9 加標(biāo)回收率的測定67-68
• 4.4 本章小結(jié)68-69
• 5 結(jié)論與展望69-71
• 5.1 主要結(jié)論69
• 5.2 展望69-71
• 參考文獻(xiàn)71-78
• 作者簡歷78

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：617014