本文關(guān)鍵詞：E3泛素連接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控及機(jī)制研究

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【摘要】：固有免疫應(yīng)答是機(jī)體防御病原入侵的第一道防線。固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)等抗原提呈細(xì)胞通過其表面模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)檢測(cè)微生物分子成分—病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),PRRs也能夠識(shí)別來源于損傷組織和壞死細(xì)胞的免疫刺激產(chǎn)物,也稱作(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。這種識(shí)別對(duì)于機(jī)體防御至關(guān)重要。病毒感染時(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,這一過程依賴于免疫細(xì)胞的PRRs對(duì)病毒成分的識(shí)別。TLRs(Toll-like receptors)識(shí)別相應(yīng)PAMPs后,能夠活化一系列胞內(nèi)信號(hào)分子,最終導(dǎo)致依賴于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及依賴于干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。維甲酸誘導(dǎo)的基因I樣受體(retinoic acid-inducible gene I-like receptors,RLRs)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類RNA解旋酶,主要負(fù)責(zé)ds RNA病毒的識(shí)別。RLRs包括RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(melanoma differentiation-associated protein 5),通過與病毒的相互作用促進(jìn)IRF的活化與核轉(zhuǎn)位,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)能夠活化TLRs和RLRs。Ⅰ型干擾素可促進(jìn)200多種抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄,在病毒感染的多個(gè)階段發(fā)揮干預(yù)作用,并且能夠提高細(xì)胞毒NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞的敏感性,抵御病毒感染。泛素化(ubiquitination)是一種普遍存在的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式,可涉及眾多生物學(xué)過程。信號(hào)蛋白的泛素化修飾在固有免疫應(yīng)答中至關(guān)重要,因?yàn)樗軌蛘{(diào)控信號(hào)蛋白的活性與功能。泛素化修飾作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)機(jī)制,參與固有免疫應(yīng)答中病原微生物的識(shí)別與清除和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的抗原提呈與激活。泛素化是一個(gè)涉及3種酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng):E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶(E3 ubiquitin protein ligases,E3s)。泛素化過程對(duì)底物的特異性識(shí)別主要依賴于E3s,E3s具有龐大的家族,經(jīng)人類基因組學(xué)分析,已發(fā)現(xiàn)700余種E3s。E3s主要分為兩類:HECT(homologous to the E6-AP C terminus)E3s和RING(really interesting new gene)E3s。E3s參與免疫應(yīng)答眾多信號(hào)通路的調(diào)節(jié),例如,E3泛素連接酶RNF125對(duì)RIG-I進(jìn)行K48泛素化修飾介導(dǎo)RIG-I在蛋白酶體的降解,負(fù)向調(diào)控RIG-I信號(hào)通路;A20作為一個(gè)去泛素化的E3泛素連接酶,在病毒感染過程中可以靶向調(diào)節(jié)NF-κB和IRF信號(hào)通路。NEDD4L(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-like)是E3泛素連接酶NEDD4家族成員,屬于HECT E3s。NEDD4家族具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn):N-末端C2結(jié)構(gòu)域(amino terminal Ca2+phospholipid binding domain)、C-末端的HECT結(jié)構(gòu)域和位于二者之間的2-4個(gè)中心WW結(jié)構(gòu)域(protein protein interaction domains)。WW結(jié)構(gòu)域的不同是區(qū)分各個(gè)成員的主要標(biāo)志,并涉及成員間不同的生物學(xué)功能。NEDD4L最初是在早期胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中作為一個(gè)發(fā)育下調(diào)基因被發(fā)現(xiàn)的,NEDD4L廣泛高表達(dá)于肝、腎、心、肺等器官。已有報(bào)道NEDD4L能夠泛素化修飾上皮細(xì)胞鈉離子通道,是機(jī)體維持正常血壓的關(guān)鍵調(diào)控者,NEDD4L的突變與高血壓等心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān);NEDD4L與許多腫瘤相關(guān):在結(jié)腸癌中,NEDD4L可抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用;可泛素化降解,負(fù)向調(diào)控信號(hào)通路。也涉及到病毒如1的出芽過程。然而,到目前為止,尚未有NEDD4L在固有免疫應(yīng)答中的相關(guān)報(bào)道。已知NEDD4家族中的NEDD4、ITCH能夠通過不同的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和固有免疫應(yīng)答。NEDD4L作為一個(gè)與NEDD4高度同源,且表達(dá)廣泛的E3泛素連接酶,是否參與抗病毒固有免疫應(yīng)答的調(diào)控尚不清楚。本課題分三部分對(duì)NEDD4L在抗病毒固有免疫應(yīng)答中的調(diào)控以及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。一、NEDD4L對(duì)VSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的選擇性促進(jìn)作用在C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)VSV感染能夠上調(diào)NEDD4L的表達(dá)水平且具有時(shí)間依賴性。利用靶向干擾NEDD4L的si RNA抑制NEDD4L在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲減能夠抑制VSV誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,而對(duì)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯影響。通過將NEDD4L條件性敲除(CKO)小鼠和Lyz2cre小鼠雜交,培育出NEDD4L髓系基因敲除小鼠(NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+)和同窩野生型對(duì)照小鼠(NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-)。經(jīng)免疫印跡分析NEDD4L的敲除效率,發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NEDD4L的表達(dá)水平降低70%以上,在骨髓巨噬細(xì)胞中NEDD4L表達(dá)量降低80%以上。我們觀察到NEDD4L的缺失不影響小鼠的生長發(fā)育,并且經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析了小鼠脾臟、骨髓、外周血中免疫細(xì)胞種類與數(shù)量,發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲除并不影響小鼠免疫細(xì)胞的分化發(fā)育。在體外利用VSV感染NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-和NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了VSV誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,而促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯差異。以上研究結(jié)果說明VSV感染時(shí),NEDD4L能夠促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,但不影響促炎細(xì)胞因子的生成。二、NEDD4L調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究根據(jù)第一部分得到的結(jié)果,我們首先檢測(cè)了NEDD4L對(duì)VSV感染所活化的信號(hào)通路的影響。在不同時(shí)間點(diǎn)利用VSV感染NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-和NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠巨噬細(xì)胞,通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了TBK1和IRF3的活化,但不影響MAPKs中JNK、ERK和P38以及NF-κB中P65的活化,提示NEDD4L作用于TBK1的上游,促進(jìn)下游信號(hào)的活化。我們進(jìn)一步研究了NEDD4L作用的分子機(jī)制。在病毒感染激活的信號(hào)通路中,泛素連接酶TRAF3位于TBK1的上游,可發(fā)生泛素化修飾調(diào)控RLRs、TLRs信號(hào),是調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。通過分析NEDD4L的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)NEDD4L具有多個(gè)TRAF結(jié)合位點(diǎn)。因此我們猜測(cè),NEDD4L或許是通過與TRAF3相互作用促進(jìn)了下游信號(hào)分子TBK1和IRF3的活化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,我們利用VSV感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以激活NEDD4L參與的信號(hào)通路,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定NEDD4L能夠與TRAF3相互結(jié)合。為了進(jìn)一步尋找NEDD4L與TRAF3相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,我們根據(jù)NEDD4L分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建了其不同結(jié)構(gòu)域缺失的突變體:分別為N-末端C2結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD4L-δC2),C-末端HECT結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD4L-δHECT),C2及WW結(jié)構(gòu)域缺失突變體(NEDD4L-δCW)以及位于HECT結(jié)構(gòu)域中的943位半胱氨酸殘基突變體(NEDD4L-C943A)。我們將NEDD4L及其不同突變體的表達(dá)質(zhì)粒與TRAF3共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞,經(jīng)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)C2及WW結(jié)構(gòu)域的缺失(NEDD4L-δCW)會(huì)阻礙NEDD4L與TRAF3的結(jié)合,而C2結(jié)構(gòu)域的缺失(NEDD4L-δC2)并不影響其與TRAF3的結(jié)合,說明WW結(jié)構(gòu)域是二者相互結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)域。我們繼而檢測(cè)了二者的相互作用方式。NEDD4L作為E3泛素連接酶,能夠特異性識(shí)別底物并對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾發(fā)揮功能。TRAF3能夠發(fā)生泛素化修飾參與信號(hào)強(qiáng)弱的調(diào)控。因此,我們首先檢測(cè)了NEDD4L對(duì)TRAF3泛素化水平的影響。我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染NEDD4L、TRAF3和泛素(Ubiquitin,Ub)的表達(dá)質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)NEDD4L可明顯促進(jìn)TRAF3的泛素化。我們進(jìn)一步尋找了NEDD4L對(duì)TRAF3泛素化修飾的必要功能域,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HECT結(jié)構(gòu)域缺失(NEDD4L-δHECT)顯著抑制了NEDD4L對(duì)TRAF3的泛素化,說明NEDD4L是通過HECT結(jié)構(gòu)域泛素化修飾TRAF3。C2結(jié)構(gòu)域缺失(NEDD4L-δC2)顯著促進(jìn)了TRAF3的泛素化,提示C2結(jié)構(gòu)域在功能上屬于自我抑制基序。隨后,我們利用Ub及其K63、K48、K29、K11位賴氨酸殘基突變的質(zhì)粒與TRAF3、NEDD4L共轉(zhuǎn)染,以明確NEDD4L對(duì)TRAF3的泛素化方式,發(fā)現(xiàn)K29賴氨酸殘基突變體(Ub-K29R)顯著抑制了NEDD4L對(duì)TARF3的泛素化,說明NEDD4L對(duì)TRAF3的修飾為K29泛素化修飾。第二部分結(jié)果說明,NEDD4L通過其WW結(jié)構(gòu)域與TRAF3相互結(jié)合,通過HECT結(jié)構(gòu)域?qū)RAF3進(jìn)行K29泛素化修飾,增強(qiáng)了下游信號(hào)分子IRF3的活化,促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,并且,C2結(jié)構(gòu)域在功能上屬于自我抑制基序。三、NEDD4L在體內(nèi)通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抵御病毒感染我們進(jìn)一步探討了NEDD4L在病毒感染性疾病中的作用,我們通過腹腔注射VSV建立VSV感染的動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠血清中的IFN-β的水平顯著低于NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-小鼠。然后,我們檢測(cè)了VSV感染小鼠肝臟、脾臟中VSV的復(fù)制水平。數(shù)據(jù)顯示NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠脾臟和肝臟中VSV RNA擴(kuò)增水平以及組織研磨液中VSV TCID50顯著高于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。提示NEDD4L在體內(nèi)能夠抑制病毒在組織中的復(fù)制。結(jié)果說明,VSV感染小鼠時(shí),NEDD4L在體內(nèi)通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抑制了VSV在組織細(xì)胞中的增殖,提高了小鼠的抗病毒能力。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中,NEDD4L能夠促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生;明確了NEDD4L依賴其WW結(jié)構(gòu)域直接與TRAF3相互結(jié)合,通過其HECT結(jié)構(gòu)域?qū)RAF3進(jìn)行K29泛素化修飾,增強(qiáng)了下游信號(hào)分子IRF3的活化,促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,從而增強(qiáng)小鼠對(duì)病毒感染性疾病的防御能力,與此同時(shí),C2結(jié)構(gòu)域在防止過度免疫應(yīng)答導(dǎo)致的免疫損傷中發(fā)揮了作用。本課題揭示了E3泛素連接酶NEDD4L能夠調(diào)控抗病毒固有免疫應(yīng)答,豐富了對(duì)Ⅰ型干擾素調(diào)控的認(rèn)識(shí),為病毒感染性疾病的免疫治療以及抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：E3泛素連接酶NEDD4L 泛素化 巨噬細(xì)胞 VSV Ⅰ型干擾素 固有免疫
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-10
• ABSTRACT10-16
• 縮略詞表16-18
• 前言18-21
• 第一部分 NEDD4L對(duì)VSV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的 選擇性促進(jìn)作用21-36
• 一、材料與方法22-27
• 二、結(jié)果27-34
• 三、討論34-36
• 第二部分 NEDD4L選擇性調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究36-55
• 一、材料與方法37-40
• 二、結(jié)果40-51
• 三、討論51-55
• 第三部分 NEDD4L在體內(nèi)通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的 產(chǎn)生抵御病毒感染55-62
• 一、材料與方法56-58
• 二、結(jié)果58-61
• 三、討論61-62
• 小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 文獻(xiàn)綜述68-78
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 在讀期間發(fā)表論文情況78
• 參加科研工作情況78-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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本文編號(hào)：603165