發(fā)布時(shí)間：2017-07-27 18:15

  本文關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌代謝調(diào)控及轉(zhuǎn)錄傳感元件的研究

  更多相關(guān)文章： 肺炎克雷伯氏桿菌 大腸桿菌 代謝調(diào)控 sigma因子 3-羥基丙酸

【摘要】：3-羥基丙酸(3-HP)為非手性有機(jī)酸,化學(xué)性質(zhì)活躍,可轉(zhuǎn)化為一系列重要化合物,且具有化學(xué)變通性。目前,商業(yè)化生產(chǎn)3-HP多為化學(xué)合成法,成本高、轉(zhuǎn)化率低、分離純化難度大,使得其生產(chǎn)方法亟待完善。微生物法產(chǎn)3-HP具有成本低和污染少等優(yōu)勢(shì)。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,微生物生產(chǎn)3-HP引起人們關(guān)注。然而,微生物產(chǎn)3-HP的模式化生產(chǎn)仍然存在挑戰(zhàn)。3-HP的研究需從多方面提高其產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率,比如代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。為此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)與大腸桿菌(Escherichia coli)的代謝調(diào)控及轉(zhuǎn)錄傳感元件進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與工作包括以下三方向內(nèi)容：1.K. pneumoniae中轉(zhuǎn)錄傳感元件與pk啟動(dòng)子相互作用的研究。考察了RNA聚合酶的σ因子與甘油脫水酶pk啟動(dòng)子的親和性,旨在增強(qiáng)3-HP合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),提高3-HP的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)篩選了3個(gè)sigma因子rpoE、rpoS、dksA并對(duì)其進(jìn)行超表達(dá)。引入卡那霉素抗性基因的啟動(dòng)子Pkana以排除甘油脫水酶自身的pk啟動(dòng)子對(duì)此3個(gè)因子超表達(dá)的干擾,采用綠色熒光蛋白基因(gfp)以驗(yàn)證表達(dá)量的強(qiáng)弱。結(jié)果發(fā)現(xiàn),rpoE的表達(dá)增強(qiáng)了pk啟動(dòng)子的效率。于是將醛脫氫酶的基因ald4替換gfp,得到重組菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)。酶活和SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),ald4的酶活所提高,SDS-PAGE中顯示ald4的表達(dá)條帶。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,重組工程菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP產(chǎn)量是對(duì)照組K. pneumoniae(pET-pk-ald4)的1.6倍。上罐發(fā)酵結(jié)果表明,重組菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP和1,3-丙二醇(1,3-PD)的轉(zhuǎn)化率分別為0.105 mol/mol和0.34 mol/mol,總轉(zhuǎn)化率為0.445 mol/mol。3-HP和1,3-PD的產(chǎn)量得以顯著提高。因此,rpoE和pk啟動(dòng)子的適配性更高,提高了pk啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率,促進(jìn)了后續(xù)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。2. E. coli和K. pneumoniae的共培養(yǎng)研究。構(gòu)建出攜帶不同抗性的K.pneumoniae與E. coli,以辨別并探究?jī)删幕炀w系。因此,克隆了E.coli中的cm基因,構(gòu)建了重組工程菌E. coli(pET-cm)和K. pneumoniae(pET-28a)。E. coli(pET-cm)攜帶氯霉素和卡那霉素雙重抗性,而K. pneumoniae(pET-28a)只攜帶卡那霉素抗性�？疾炝薑. pneumoniae與E. coli單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的相對(duì)菌落數(shù)及存活率,結(jié)果顯示,共培養(yǎng)中E. coli受到的生長(zhǎng)抑制比K. pneumoniae更大,K. pneumoniae為共培養(yǎng)中的優(yōu)勢(shì)菌種。3.針對(duì)K. pneumoniae中3-HP代謝分向的研究。弱化K. pneumoniae中產(chǎn)3-HP的副產(chǎn)物途徑,降低或消除其中一些副產(chǎn)物對(duì)3-HP的影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以提高3-HP的產(chǎn)量為前提,探究3-HP代謝流之間的相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)涉及K. pneumoniae甘油途徑中的八個(gè)相關(guān)酶基因：pmd(KPN 01632)、poxB(KPN 00904)、frdB(KPN 04552)、fumC(KPN 01517)、 dhaT(KPN 03491)、ilvH(KPN 00083)、adhP(KPN 01853)和pflB(KPN 00931)。分別敲除了以上8個(gè)酶基因,弱化了八條代謝分支途徑,構(gòu)建了八株單基因敲除工程菌。對(duì)8株單基因敲除工程菌途徑代謝物進(jìn)行檢測(cè),分析單基因敲除工程菌中代謝流的變化,篩選出高產(chǎn)3-HP的工程菌。此外,對(duì)篩選出的最合適的兩種酶基因進(jìn)行組合敲除,測(cè)定組合敲除菌途徑中代謝物的變化。在組合敲除菌中導(dǎo)入高產(chǎn)3-HP重組質(zhì)粒tac-puuC,分析代謝物產(chǎn)量。由8株單基因敲除工程菌的搖瓶發(fā)酵結(jié)果可知,K.pneumoniae (△adhP)、K. pneumoniae(△pflB)的3-HP和1,3-PD相對(duì)產(chǎn)量較高,更適合做多基因敲除的表達(dá)宿主。由組合敲除菌的搖瓶和上罐發(fā)酵結(jié)果可知,K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)在60 h時(shí)3-HP的產(chǎn)量達(dá)到了66.91 g/L,1,3-丙二醇的產(chǎn)量達(dá)到了3.85 g/L。此外,該重組菌K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)的乳酸產(chǎn)量最高只為19.40 g/L,副產(chǎn)物的產(chǎn)量降低至對(duì)照組的1/3。該菌是生產(chǎn)3-HP的理想菌株。
【關(guān)鍵詞】：肺炎克雷伯氏桿菌 大腸桿菌 代謝調(diào)控 sigma因子 3-羥基丙酸
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378;Q78
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-21
• 第一章 緒論21-31
• 1.1 3-HP簡(jiǎn)介21-22
• 1.2 3-HP的合成方法22-23
• 1.2.1 化學(xué)合成22
• 1.2.2 生物合成法22-23
• 1.2.2.1 涉及3-HP的微生物代謝作用22
• 1.2.2.2 3-HP的生物合成途徑22-23
• 1.3 K.pneumoniae與E.coli23-24
• 1.4 混菌體系概述24-25
• 1.5 RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究25-26
• 1.5.1 RNA聚合酶概述25-26
• 1.5.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的研究26
• 1.5.3 基于σ因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控在改進(jìn)細(xì)胞表型方面的研究26
• 1.6 代謝調(diào)控概述26-27
• 1.7 合成生物學(xué)方法27
• 1.8 基因敲除技術(shù)27-29
• 1.8.1 RecA系統(tǒng)28
• 1.8.2 Red重組系統(tǒng)28
• 1.8.3 ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)28
• 1.8.4 CRISPR技術(shù)28-29
• 1.9 立項(xiàng)意義29-31
• 第二章 基于σ因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控在改進(jìn)細(xì)胞表型方面的研究31-49
• 2.1 引言31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料31-33
• 2.2.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件31-32
• 2.2.2 基因和重組質(zhì)粒32
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 2.3.1 重組菌的構(gòu)建33-36
• 2.3.1.1 基因組的提取33-34
• 2.3.1.2 質(zhì)粒的提取34
• 2.3.1.3 PCR反應(yīng)體系及其產(chǎn)物的回收34
• 2.3.1.4 切膠回收34-35
• 2.3.1.5 雙酶切反應(yīng)和DNA連接反應(yīng)35
• 2.3.1.6 瓊脂糖凝膠電泳35
• 2.3.1.7 熱轉(zhuǎn)化法35-36
• 2.3.1.8 電轉(zhuǎn)化法36
• 2.3.2 綠色熒光蛋白分析36
• 2.3.2.1 制樣36
• 2.3.2.2 流式細(xì)胞儀使用方法36
• 2.3.3 酶活分析36-37
• 2.3.4 搖瓶和上罐發(fā)酵37
• 2.3.5 SDS-PAGE分析37-38
• 2.3.5.1 蛋白電泳的制樣37
• 2.3.5.2 濃縮膠和分離膠的制備37-38
• 2.3.5.3 染色液和脫色液的制備38
• 2.3.6 代謝物分析方法38
• 2.4 結(jié)果與討論38-47
• 2.4.1 K.pneumoniae基因組的提取38-39
• 2.4.2 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的克隆39-40
• 2.4.3 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的連接轉(zhuǎn)化40-41
• 2.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)量41-42
• 2.4.5 重組菌的ALD4酶活分析42-43
• 2.4.6 SDS-PAGE分析43-44
• 2.4.7 搖瓶發(fā)酵分析44-46
• 2.4.8 K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)上罐發(fā)酵的研究46-47
• 2.5 本章小結(jié)47-49
• 第三章 大腸桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌的共培養(yǎng)研究49-59
• 3.1 引言49
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 3.2.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件49-50
• 3.2.2 基因和重組質(zhì)粒50
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 3.3.1 重組菌的構(gòu)建50-53
• 3.3.1.1 質(zhì)粒的提取51
• 3.3.1.2 cm基因的克隆51-52
• 3.3.1.3 cm基因的切膠回收52
• 3.3.1.4 pET-cm載體的酶切連接反應(yīng)52
• 3.3.1.5 瓊脂糖凝膠電泳52
• 3.3.1.6 載體pET-cm的熱轉(zhuǎn)化52-53
• 3.3.1.7 載體pET-28a的電轉(zhuǎn)化53
• 3.3.2 重組工程菌的培養(yǎng)53
• 3.3.3 分析測(cè)定53-54
• 3.4 結(jié)果與討論54-57
• 3.4.1 工程菌E.coli(pET-cm)和K.pneumoniae(pET-28a)的構(gòu)建54
• 3.4.2 共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)菌體生物量的分析54-55
• 3.4.3 菌落數(shù)的測(cè)定55-57
• 3.5 本章小結(jié)57-59
• 第四章 肺炎克雷伯氏桿菌中3-羥基丙酸代謝分向的研究59-77
• 4.1 引言59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料59-61
• 4.2.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件59-60
• 4.2.2 基因和重組質(zhì)粒60
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑60-61
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法61-66
• 4.3.1 RecA重組系統(tǒng)61-62
• 4.3.2 八個(gè)單敲除載體和菌株的構(gòu)建62-64
• 4.3.2.1 基因組模板的提取62
• 4.3.2.2 pET-cm質(zhì)粒的提取62
• 4.3.2.3 同源臂基因序列的PCR反應(yīng)體系及其產(chǎn)物回收62-63
• 4.3.2.4 同源臂基因序列切膠回收63
• 4.3.2.5 雙酶切反應(yīng)和DNA連接反應(yīng)63
• 4.3.2.6 瓊脂糖凝膠電泳63-64
• 4.3.2.7 熱轉(zhuǎn)化法64
• 4.3.2.8 敲除質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化法64
• 4.3.3 單基因敲除與雙基因敲除64
• 4.3.3.1 單基因敲除64
• 4.3.3.2 雙基因敲除64
• 4.3.4 搖瓶和上罐發(fā)酵64-65
• 4.3.5 SDS-PAGE分析65-66
• 4.3.5.1 蛋白電泳的制樣65
• 4.3.5.2 濃縮膠和分離膠的制備65-66
• 4.3.5.3 染色液和脫色液的制備66
• 4.3.6 代謝物分析方法66
• 4.4 結(jié)果與討論66-76
• 4.4.1 八個(gè)單基因敲除菌和K.pneumoniae(tac-puuc-△adhP-△pflB)的構(gòu)建66-69
• 4.4.2 單基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵分析69-71
• 4.4.3 K.pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的搖瓶發(fā)酵分析71-74
• 4.4.4 K.pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的上罐發(fā)酵分析74-75
• 4.4.5 SDS-PAGE分析75-76
• 4.5 本章小結(jié)76-77
• 第五章 總結(jié)與展望77-79
• 5.1 總結(jié)77
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)77-78
• 5.3 展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-83
• 附錄83-85
• 附錄1 本研究用到的試劑83-84
• 附錄2 本研究所用到的儀器84-85
• 致謝85-87
• 導(dǎo)師和作者簡(jiǎn)介87-89
• 研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文89-90
• 北京化工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士研究生學(xué)位論文答辯委員會(huì)決議書90-91

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