本文關(guān)鍵詞：Trio基因在小鼠海馬區(qū)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶中的功能研究

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【摘要】：背景介紹：在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,Trio蛋白是一種非常重要的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子。Trio蛋白擁有多個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白功能結(jié)構(gòu)域。由于這些功能域的催化作用,Trio蛋白廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)中細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)及肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)過(guò)程,對(duì)細(xì)胞遷移、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及神經(jīng)細(xì)胞軸突導(dǎo)向等細(xì)胞活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)Trio基因在小鼠發(fā)育中功能的研究結(jié)果已表明：如Trio基因在小鼠中被完全敲除,小鼠在胚胎期時(shí)即會(huì)死亡。對(duì)這些死亡小鼠胚胎的組織學(xué)分析顯示：Trio基因完全敲除小鼠胚胎在發(fā)育至E18.5天時(shí)即會(huì)出現(xiàn)大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)的細(xì)胞排列紊亂及組織發(fā)育缺陷。對(duì)Nestin-Trio-/-小鼠(Trio基因在整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)中被特異性敲除的小鼠)的研究表明：Trio基因在神經(jīng)系統(tǒng)中被敲除后,所構(gòu)建的Nestin-Trio-/-小鼠存活率非常低,出生后即會(huì)大量死亡,在成年前這些仔鼠會(huì)全部死亡。對(duì)出生后幸存的Nestin-Trio-/-小鼠的研究證明：這些小鼠在行為學(xué)上出現(xiàn)了共濟(jì)失調(diào)等表型,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育上存在著小腦發(fā)育缺陷等一系列發(fā)育畸形性狀。由于Nestin-Trio-/-小鼠在成年前會(huì)全部死亡,無(wú)法得到成年的Trio基因敲除小鼠以進(jìn)行成體行為學(xué)實(shí)驗(yàn),這限制了Trio基因在成年小鼠發(fā)育中的進(jìn)一步功能研究。為解決這一問(wèn)題,我們將Trio-Floxed小鼠和EMX1-Cre小鼠進(jìn)行交配,最終構(gòu)建了EMX1-Trio-/-小鼠。得到EMX1-Trio-/-小鼠后,我們采取動(dòng)物行為學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Trio基因在小鼠發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行了研究。研究目的：通過(guò)構(gòu)建EMX1-Trio-/-小鼠模型的辦法來(lái)探究Trio基因在小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育中所發(fā)揮的功能。通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)探究Trio基因海馬區(qū)域特異性敲除后成年小鼠智力所受到的影響。實(shí)驗(yàn)方法：將EMX1-Cre小鼠與Trio-Floxed小鼠進(jìn)行交配得到Trio基因的條件性敲除小鼠即EMX1-Trio-/-小鼠。EMX1-Cre小鼠特異性地在小鼠的大腦皮層及海馬區(qū)域處表達(dá)Cre重組酶并敲除兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點(diǎn)的Trio基因片段。將得到的EMX1-Trio-/-小鼠飼養(yǎng)至成年,對(duì)成年小鼠進(jìn)行一系列行為學(xué)測(cè)試以研究小鼠在.Trio基因特異性敲除后的智力水平波動(dòng)。除了行為學(xué)測(cè)試外,我們還利用其他實(shí)驗(yàn)方法,如組織學(xué)石蠟切片HE染色、Western Blot等,對(duì)EMX1-Trio-/-小鼠的大腦發(fā)育進(jìn)行研究。小鼠大腦的組織學(xué)研究和智力測(cè)試的結(jié)果相互結(jié)合,能夠揭示Trio基因在小鼠大腦發(fā)育及智力形成中所起到的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：EMX1-Cre小鼠能特異性的在大腦皮層和海馬區(qū)域組織范圍內(nèi)表達(dá)Cre酶以敲除基因組中兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點(diǎn)的目的基因片段。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：得到的EMX1-Trio-/-小鼠可以存活至成年時(shí)期并被用于成年小鼠的相關(guān)研究。對(duì)EMX1-Trio-/-,小鼠的研究表明：Trio基因在大腦及海馬區(qū)域的特異性敲除導(dǎo)致成年的EMX1-Trio-/-小鼠大腦出現(xiàn)了一系列畸形。從外觀上觀察,和WT小鼠相比,EMX1-Trio-/-,小鼠大腦體積出現(xiàn)了縮小。從組織學(xué)切片的HE染色結(jié)果上觀察：通過(guò)Cre重組酶特異性的在小鼠大腦皮層及海馬區(qū)域敲除Trio基因后,成年EMX1-Trio-/-小鼠的海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了發(fā)育缺陷。海馬DG區(qū)和CA區(qū)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了扭曲。成年EMX1-Trio-/-小鼠的海馬顆粒細(xì)胞排列出現(xiàn)了紊亂。對(duì)EMX1-Trio-/-成年小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：Trio基因被EMX1-Cre重組酶特異性敲除后,小鼠海馬依賴型的智力發(fā)育受到了嚴(yán)重的損傷。此外,EMX1-Trio-/-小鼠的體重在P30天前顯著低于WT型小鼠,但隨著時(shí)間的推移體重將會(huì)恢復(fù)。雖然EMX1-Trio-/-小鼠的體重能夠最終趕上WT型小鼠,EMX1-Trio-/-小鼠的腦重則一直低于WT型小鼠,無(wú)法恢復(fù)正常水平。結(jié)論：Trio基因通過(guò)控制小鼠大腦及海馬的結(jié)構(gòu)發(fā)育以控制成年小鼠智力水平的形成。Trio基因在大腦皮層和海馬區(qū)域的特異性敲除將導(dǎo)致大腦皮層和海馬區(qū)域因神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)紊亂而出現(xiàn)發(fā)育缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致大腦體積縮小、腦重下降及海馬結(jié)構(gòu)畸形。成年EMX1-Trio-/-小鼠的智力因海馬畸形而受到損傷,智力出現(xiàn)了下降,在爭(zhēng)奪乳汁中處于劣勢(shì)。攝入的營(yíng)養(yǎng)不足使得小鼠早期體重出現(xiàn)了下降。綜上所述,Trio基因?qū)π∈蟠竽X及海馬區(qū)的發(fā)育起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)對(duì)成年小鼠的智力發(fā)育及個(gè)體形態(tài)發(fā)育也具有重要的影響。
【關(guān)鍵詞】：Trio基因 海馬 大腦發(fā)育 小鼠智力
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R338
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表11-12
• 第1章：緒論12-21
• 1. 基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介12-14
• 2. Trio基因的研究進(jìn)展簡(jiǎn)介14-21
• 2.1 Trio基因的簡(jiǎn)介14-15
• 2.2 Trio蛋白的結(jié)構(gòu)研究15-16
• 2.3 Trio蛋白在神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用研究16-17
• 2.4 Trio基因在模式動(dòng)物中的研究17-18
• 2.5 目前所面臨的問(wèn)題及解決辦法18-21
• 第2章：實(shí)驗(yàn)材料及方法21-42
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料21-27
• 1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21-22
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑22-26
• 1.2.1. 基因型鑒定22-23
• 1.2.2. Western Blot23-24
• 1.2.3. 石蠟切片H&E染色24-26
• 1.3. 雜品與耗材26
• 1.4. 所需儀器26-27
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法27-42
• 2.1. Trio基因條件敲除小鼠的構(gòu)建27-28
• 2.2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的基因型鑒定28-30
• 2.2.1. 提取鼠尾基因組28
• 2.2.2. PCR擴(kuò)增鼠尾基因組28-29
• 2.2.3. PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳29-30
• 2.3. Western blot檢測(cè)Trio蛋白30-35
• 2.3.1. 提取海馬組織蛋白30-31
• 2.3.2. 蛋白樣品的SDS-PAGE電泳31-33
• 2.3.3. Western Blot電泳蛋白轉(zhuǎn)膜33
• 2.3.4. 對(duì)轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜進(jìn)行封閉33
• 2.3.5. PVDF膜的抗體孵育33-34
• 2.3.6. 抗體孵育后PVDF膜顯影定影34-35
• 2.4. Morris水迷宮測(cè)試35-37
• 2.4.1. Morris水迷宮測(cè)試的準(zhǔn)備工作35-36
• 2.4.2. 獲得性訓(xùn)練(Acquisition Phase)36
• 2.4.3. 探查訓(xùn)練(Probe Trial 1)36-37
• 2.4.4. Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)37
• 2.5. 場(chǎng)景性恐懼條件測(cè)試37-39
• 2.5.1. 場(chǎng)景性恐懼測(cè)試步驟38-39
• 2.5.2. 場(chǎng)景性恐懼測(cè)試注意事項(xiàng)39
• 2.6. 組織切片分析39-42
• 2.6.1. 小鼠大腦石蠟切片步驟39-41
• 2.6.2. 小鼠大腦石蠟切片H&E染色41-42
• 2.7. 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析42
• 第3章：實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-49
• 1. Trio基因在EMX1-Trio~(-/-)小鼠海馬組織中被敲除42-43
• 2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的總體形態(tài)出現(xiàn)異常43-44
• 3. EMX1-Trio~(-/-)成年小鼠的智力水平顯著下降44-47
• 4. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸形47-49
• 第4章：討論49-57
• 1. 小鼠的發(fā)育受到Trio基因的調(diào)控51-54
• 1.1 Trio基因控制小鼠大腦的發(fā)育51-52
• 1.2 Trio基因敲除影響了EMX1-Trio~(-/-)小鼠的體重及腦重52-54
• 1.2.1 小鼠的體重受到Trio基因的調(diào)控53
• 1.2.2 EMX1-Trio~(-/-)小鼠的腦重受到Trio基因敲除的影響53-54
• 2. EMX1-Trio~(-/-)小鼠的海馬損傷導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)能力下降54-56
• 2.1 小鼠的海馬決定著小鼠智力水平的形成54-55
• 2.2 Trio基因的敲除導(dǎo)致EMX1-Trio~(-/-)小鼠海馬的畸形及智力的下降55-56
• 3. EMX1-Trio~(-/-)小鼠可為人類(lèi)神經(jīng)性疾病的研究提供材料56-57
• 第5章：結(jié)論57-58
• 主要參考文獻(xiàn)58-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文62
• 致謝62-63
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表63

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