本文關鍵詞：單核細胞增生李斯特菌p60蛋白結構域功能鑒定及其底物結合特性研究

  更多相關文章： 單核細胞增生李斯特菌 p60蛋白 結構域功能 LysM結構域 底物識別結合

【摘要】：單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一種典型的人獸共患病食源性病原菌,在自然界中普遍存在。由于其具有感染人類和多種動物而導致嚴重李斯特菌病的特性,該菌已引起了廣泛關注。p60蛋白為該病原菌產生的一種胞外蛋白,與李斯特菌的致病性密切相關�，F(xiàn)有的研究結果表明p60蛋白在Lm發(fā)病機理中的主要作用與細胞分裂、宿主細胞入侵、細菌細胞表面結構的維持及免疫活性細胞壁成分的釋放有關。因此,p60蛋白也被稱為侵染輔助蛋白(invasion-associated protein, Iap)。p60蛋白的三級結構預測結果顯示：若在270位氨基酸附近將p60蛋白切開,可以獲得兩個能夠彼此獨立存在的結構域(N端結構域和C端結構域)。同時,氨基酸序列分析顯示：p60蛋白的N端不僅含有兩個LysM結構域的氨基酸基序,其間還存在著一個SH3結構域的氨基酸基序,而p60蛋白的C端只含有一個NlpC/P60家族結構域的氨基酸基序。但到目前為止,這些結構域在p60蛋白中的確切功能還不清楚。本研究表達和純化了全長p60蛋白、LysM1結構域、LysM2結構域、SH3結構域、C端結構域、LysM1-SH3結構域共存體以及LysM1結構域缺失體共七種重組蛋白。本研究利用Insoluble Pulldown法鑒定出p60蛋白的N端結構域行使結合功能,且LysM1、SH3、LysM2結構域均具有結合活性但LysM1的活性較弱,而p60蛋白的C端結構域則完全不具有結合活性。隨后,本研究利用復性SDS-PAGE法鑒定出p60蛋白的C端結構域行使裂解功能。此外,本研究發(fā)現(xiàn)LysM1-SH3結構域共存體的結合活性不單單是LysM1與SH3結構域結合活性的簡單相加,這表明LysM1與SH3結構域之間可能存在著協(xié)同結合底物的作用。最后,本研究綜合運用Insoluble Pulldown法和比濁法測定了LysM1結構域缺失體的結合活性和裂解活性,實驗結果表明：雖然LysM1結構域的缺失只導致p60蛋白整體的結合活性下降約10%,但會使p60蛋白整體裂解活性的降幅達到70%。已有研究顯示：p60蛋白具有裂解細菌細胞壁的活性,其對細胞壁的裂解可以幫助Lm逃避宿主的先天免疫系統(tǒng),而使其能在宿主細胞中存活和繁殖,導致宿主出現(xiàn)嚴重的李斯特菌病。而p60蛋白與底物的識別與結合是其發(fā)揮裂解活性的首要前提,因此對p60蛋白的底物結合特性進行全面研究也是本研究的一項重要工作。本研究確定了p60蛋白不是金屬蛋白且該蛋白內不含有二硫鍵。當溫度為36℃,pH值為7.5時,p60蛋白的結合活性達到最大,且其活性能被10mM的Na+、K+、和Ca2+分別提高11%、15%以及21%。本研究還發(fā)現(xiàn),p60蛋白作為一種細菌LysM蛋白并不區(qū)分GlcNAc-MurNAc與GlcNAc多聚物。本研究也得出了N-乙酰葡糖胺C2’位置上的酰胺基在結合反應中是至關重要的結論。最后,分子篩層析實驗結果表明p60蛋白在緩沖液中是以單體的形式存在。
【關鍵詞】：單核細胞增生李斯特菌 p60蛋白 結構域功能 LysM結構域 底物識別結合
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 縮略語與符號語說明9-10
• 第一章 文獻綜述10-23
• 1.1 單核細胞增生李斯特菌概況10-14
• 1.1.1 李斯特菌分型10-11
• 1.1.2 單核細胞增生李斯特菌的生物學特性11
• 1.1.3 單核細胞增生李斯特菌的致病機制11-12
• 1.1.4 單核細胞增生李斯特菌的主要毒力因子12-14
• 1.2 p60蛋白是一種與單核細胞增生李斯特菌有關的侵染輔助蛋白14-15
• 1.3 p60蛋白具有水解肽聚糖的活性15-16
• 1.4 p60蛋白含有LysM結構域、SH3結構域和NlpC/P60家族結構域16-21
• 1.4.1 LysM結構域概述16-18
• 1.4.2 SH3結構域概述18-19
• 1.4.3 NlpC/P60家族結構域概述19-21
• 1.5 研究意義21-23
• 第二章 材料與方法23-39
• 2.1 實驗材料23-25
• 2.1.1 菌株、質粒與引物23-24
• 2.1.2 試劑與材料24-25
• 2.1.3 主要儀器25
• 2.2 溶液配制25-27
• 2.3 實驗方法27-39
• 2.3.1 全長p60蛋白重組表達質粒pR60的構建27-30
• 2.3.1.1 擴增模板的制備27
• 2.3.1.2 PCR擴增目的基因片段27
• 2.3.1.3 PCR產物回收27-28
• 2.3.1.4 目的基因片段與表達載體的酶切28-29
• 2.3.1.5 目的基因片段與表達載體的連接29
• 2.3.1.6 連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞29
• 2.3.1.7 細菌培養(yǎng)29
• 2.3.1.8 質粒抽提29-30
• 2.3.1.9 酶切篩選陽性克隆及測序鑒定30
• 2.3.2 p60蛋白結構域缺失體重組表達質粒的構建30-31
• 2.3.2.1 LysM1結構域缺失體重組表達質粒的構建30-31
• 2.3.2.2 N端結構域缺失體重組表達質粒的構建31
• 2.3.3 p60蛋白N端各結構域重組表達質粒的構建31-33
• 2.3.3.1 LysM1結構域重組表達質粒的構建31
• 2.3.3.2 LysM2結構域重組表達質粒的構建31
• 2.3.3.3 LysM1-SH3結構域共存體重組表達質粒的構建31
• 2.3.3.4 SH3結構域重組表達質粒的構建31-33
• 2.3.4 各重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導表達33-35
• 2.3.4.1 小量試表達蛋白樣品準備33
• 2.3.4.2 小量試表達蛋白樣品處理33
• 2.3.4.3 SDS—PAGE凝膠電泳檢測蛋白是否表達33-34
• 2.3.4.4 目的蛋白的大量誘導表達與鎳親和層析柱純化34
• 2.3.4.5 Ni~(2+)-NTA agarose再生34-35
• 2.3.4.6 目的蛋白的透析35
• 2.3.4.7 目的蛋白超濾濃縮與濃度測定35
• 2.3.5 枯草芽孢桿菌細胞壁的提取與純化35-36
• 2.3.6 從單核細胞增生細胞李斯特菌中提取蛋白質36
• 2.3.7 利用底物Insoluble Pulldown法鑒定蛋白結合活性36
• 2.3.8 利用比濁法與復性SDS-PAGE法鑒定蛋白裂解活性36-37
• 2.3.8.1 比濁法36-37
• 2.3.8.2 復性SDS-PAGE法37
• 2.3.9 p60蛋白最適結合條件的確定37-38
• 2.3.9.1 不同溫度對p60蛋白結合活性的影響37
• 2.3.9.2 不同pH對p60蛋白結合活性的影響37
• 2.3.9.3 不同金屬離子與化學組分對p60蛋白結合活性的影響37-38
• 2.3.10 p60蛋白底物結合特異性38
• 2.3.11 利用分子篩層析鑒定p60蛋白在溶液中的低聚狀態(tài)38-39
• 第三章 實驗結果39-59
• 3.1 重組表達質粒的構建與鑒定39-42
• 3.2 重組表達質粒的原核表達與純化42-45
• 3.2.1 p60蛋白及其LysM1結構域缺失體的表達與鎳親和層析柱純化42
• 3.2.2 p60蛋白C端結構域的表達與鎳親和層析柱純化42-43
• 3.2.3 p60蛋白LysM1結構域及LysM2結構域的表達與鎳親和層析柱純化43-44
• 3.2.4 p60蛋白SH3結構域及LysMl-SH3共存體的表達與鎳親和層析柱純化44-45
• 3.2.5 各重組蛋白的透析與濃縮45
• 3.3 p60蛋白N端結構域和C端結構域功能的鑒定45-49
• 3.4 p60蛋白N端兩種LysM結構域的生物信息學分析49-51
• 3.5 探究LysM1結構域在整個p60蛋白中的功能意義51-53
• 3.6 p60蛋白最適結合條件的確定53-56
• 3.6.1 不同溫度對p60蛋白結合活性的影響53-54
• 3.6.2 不同pH對p60蛋白結合活性的影響54-55
• 3.6.3 不同金屬離子與化學組分對p60蛋白結合活性的影響55-56
• 3.7 p60蛋白底物結合特異性56-57
• 3.8 利用分子篩層析鑒定p60蛋白在溶液中的低聚物狀態(tài)57-59
• 第四章 討論59-63
• 參考文獻63-74
• 致謝74-75
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文75-76

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