本文關(guān)鍵詞：腺相關(guān)病毒介導(dǎo)狨猴P53和P21基因沉默研究

  更多相關(guān)文章： 狨猴 P53 P21 RNA干擾 腺相關(guān)病毒

【摘要】：背景P53基因和P21基因是兩個(gè)重要的抑癌基因,它們參與細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、幫助基因修復(fù)缺陷,與腫瘤發(fā)生與發(fā)展有重要的關(guān)系。相關(guān)功能的研究在嚙齒類動(dòng)物中非常多,但是由于嚙齒動(dòng)物在遺傳學(xué)和生理學(xué)上與人類相差較大,動(dòng)物模型的應(yīng)用以及藥物的研發(fā)上受到很大局限性。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類有高度的親緣性,在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似,但是在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物上的研究受到經(jīng)濟(jì)條件、實(shí)驗(yàn)條件、倫理等制約在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用并不是十分廣泛,相應(yīng)的科研數(shù)據(jù)也欠全面,所以在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物狨猴上研究P53基因和P21基因有著重要的意義�？梢杂行а芯炕蚬δ芘c基因相互協(xié)調(diào)關(guān)系、腫瘤的生成機(jī)理、藥物開發(fā)等。目的在細(xì)胞和整體動(dòng)物水平,利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)絨猴P53和P21基因表達(dá),以期建立一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的基因調(diào)控的策略。方法(1)細(xì)胞水平：對(duì)狨猴P53和P21基因做生物信息學(xué)分析,針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)shRNA干擾序列,構(gòu)建在腺相關(guān)病毒載體上,轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞(cos-7),用熒光定量PCR方法檢測(cè)P53mRNA和P21mRNA抑制效果,以Westem blot方法檢測(cè)p53蛋白和p2l蛋白水平表達(dá)變化。(2)動(dòng)物整體水平：優(yōu)選P53基因shRNA干擾序列,包裝成含shRNA干擾序列的8型腺相關(guān)病毒,后肢靜脈注射感染狨猴；活體熒光成像檢測(cè)腺相關(guān)病毒有效感染部位和強(qiáng)度,四周后手術(shù)取少量肝臟組織,HE染色觀察細(xì)胞是否有病理變化,用Western blot和免疫組化方法檢測(cè)p53蛋白水平的變化。結(jié)果(1)細(xì)胞水平：通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),腺相關(guān)病毒載體上成功構(gòu)建狨猴P53基因和挖1基因RNA干擾片段若干,構(gòu)建的靶點(diǎn)位置全部在對(duì)應(yīng)基因的開放閱讀框內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)P21基因3個(gè)有效沉默靶點(diǎn),沉默效率分別為shRNA1(65.2±8.3)％, shRNA2(66.8±8.6)%,shRNA3(71.4±7.9)％(P0.05),對(duì)應(yīng)的蛋白下調(diào)shRNA 1(64.7 ±6.5)％,shRNA2(65.3±5.9)％,shRNA3(68.1±4.8)％(P0.05)；研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)P53基因有效RNA干擾靶點(diǎn),mRNA干擾效率分別為(82.7±8.1)%和(80.7+7.5)%(P0.05)；蛋白表達(dá)下調(diào)(77.3+11.5)%和(73.7+10.7)%(P0.05)。(2)動(dòng)物整體水平：P53基因有效靶點(diǎn)包裝成8型腺相關(guān)病毒,qPCR法測(cè)定病毒濃度達(dá)到1×1012vg/ml；2只實(shí)驗(yàn)組絨猴靜脈注射含有P53基因干擾靶點(diǎn)病毒后,經(jīng)活體熒光成像分析可見病毒在肝臟、睪丸、頸部等位置分布,證明病毒有效感染狨猴；四周后,手術(shù)取米粒般大小的肝臟組織,狨猴肝臟p53蛋白經(jīng)Western blot和免疫組化分析未見明顯變化。結(jié)論本研究在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)絨猴P53基因和P21基因表達(dá)下調(diào)；包裝的高滴度腺相關(guān)病毒能安全有效的感染狨猴部分器官,但整體動(dòng)物水平狨猴肝臟p53蛋白表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯變化；今后需在感染方式、病毒劑量、蛋白檢測(cè)方法等方面做進(jìn)一步優(yōu)化。
【關(guān)鍵詞】：狨猴 P53 P21 RNA干擾 腺相關(guān)病毒
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 1 前言9-16
• 1.1 P53基因概述9-11
• 1.2 P21基因概述11-12
• 1.3 腺相關(guān)病毒概述12-13
• 1.4 狨猴概述13-14
• 1.5 該研究意義與展望14-16
• 2 材料16-20
• 2.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.2 主要試劑16-17
• 2.3 主要儀器和設(shè)備17-19
• 2.4 主要溶液的配置19-20
• 3. 方法20-37
• 3.1 構(gòu)建含有RNA干擾片段的AAV載體20-25
• 3.2 熒光定量PCR25-28
• 3.3 Western blot28-30
• 3.4 腺相關(guān)病毒的包裝30-33
• 3.5 狨猴后肢靜脈注射病毒33
• 3.6 活體熒光成像33-34
• 3.7 手術(shù)取少量肝臟組織34
• 3.8 冰凍切片免疫熒光34-35
• 3.9 石蠟切片免疫組化35-36
• 3.10 肝臟組織Western Blotting36-37
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-48
• 4.1 腺相關(guān)病毒干擾載體構(gòu)建37-39
• 4.2 細(xì)胞水平沉默效率的驗(yàn)證39-42
• 4.3 病毒包裝42-43
• 4.4 病毒感染狨猴43-44
• 4.5 活體熒光成像44-45
• 4.6 肝臟組織P53基因沉默效率檢測(cè)45-48
• 討論48-51
• 總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 縮略詞56-58
• 個(gè)人信息58-59
• 致謝59-60

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本文編號(hào)：513104