本文關鍵詞：腺相關病毒介導狨猴P53和P21基因沉默研究

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【摘要】：背景P53基因和P21基因是兩個重要的抑癌基因,它們參與細胞周期調控、促進細胞凋亡、幫助基因修復缺陷,與腫瘤發(fā)生與發(fā)展有重要的關系。相關功能的研究在嚙齒類動物中非常多,但是由于嚙齒動物在遺傳學和生理學上與人類相差較大,動物模型的應用以及藥物的研發(fā)上受到很大局限性。非人靈長類動物和人類有高度的親緣性,在組織結構、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似,但是在非人靈長類動物上的研究受到經濟條件、實驗條件、倫理等制約在生物醫(yī)學研究中的應用并不是十分廣泛,相應的科研數據也欠全面,所以在非人靈長類動物狨猴上研究P53基因和P21基因有著重要的意義�？梢杂行а芯炕蚬δ芘c基因相互協(xié)調關系、腫瘤的生成機理、藥物開發(fā)等。目的在細胞和整體動物水平,利用RNA干擾技術下調絨猴P53和P21基因表達,以期建立一種非人靈長類動物的基因調控的策略。方法(1)細胞水平：對狨猴P53和P21基因做生物信息學分析,針對靶序列設計shRNA干擾序列,構建在腺相關病毒載體上,轉染非洲綠猴腎細胞(cos-7),用熒光定量PCR方法檢測P53mRNA和P21mRNA抑制效果,以Westem blot方法檢測p53蛋白和p2l蛋白水平表達變化。(2)動物整體水平：優(yōu)選P53基因shRNA干擾序列,包裝成含shRNA干擾序列的8型腺相關病毒,后肢靜脈注射感染狨猴；活體熒光成像檢測腺相關病毒有效感染部位和強度,四周后手術取少量肝臟組織,HE染色觀察細胞是否有病理變化,用Western blot和免疫組化方法檢測p53蛋白水平的變化。結果(1)細胞水平：通過生物信息學發(fā)現,腺相關病毒載體上成功構建狨猴P53基因和挖1基因RNA干擾片段若干,構建的靶點位置全部在對應基因的開放閱讀框內。研究發(fā)現P21基因3個有效沉默靶點,沉默效率分別為shRNA1(65.2±8.3)％, shRNA2(66.8±8.6)%,shRNA3(71.4±7.9)％(P0.05),對應的蛋白下調shRNA 1(64.7 ±6.5)％,shRNA2(65.3±5.9)％,shRNA3(68.1±4.8)％(P0.05)；研究發(fā)現2個P53基因有效RNA干擾靶點,mRNA干擾效率分別為(82.7±8.1)%和(80.7+7.5)%(P0.05)；蛋白表達下調(77.3+11.5)%和(73.7+10.7)%(P0.05)。(2)動物整體水平：P53基因有效靶點包裝成8型腺相關病毒,qPCR法測定病毒濃度達到1×1012vg/ml；2只實驗組絨猴靜脈注射含有P53基因干擾靶點病毒后,經活體熒光成像分析可見病毒在肝臟、睪丸、頸部等位置分布,證明病毒有效感染狨猴；四周后,手術取米粒般大小的肝臟組織,狨猴肝臟p53蛋白經Western blot和免疫組化分析未見明顯變化。結論本研究在細胞水平實現絨猴P53基因和P21基因表達下調；包裝的高滴度腺相關病毒能安全有效的感染狨猴部分器官,但整體動物水平狨猴肝臟p53蛋白表達未發(fā)現明顯變化；今后需在感染方式、病毒劑量、蛋白檢測方法等方面做進一步優(yōu)化。
【關鍵詞】：狨猴 P53 P21 RNA干擾 腺相關病毒
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 1 前言9-16
• 1.1 P53基因概述9-11
• 1.2 P21基因概述11-12
• 1.3 腺相關病毒概述12-13
• 1.4 狨猴概述13-14
• 1.5 該研究意義與展望14-16
• 2 材料16-20
• 2.1 質粒、細胞和實驗動物16
• 2.2 主要試劑16-17
• 2.3 主要儀器和設備17-19
• 2.4 主要溶液的配置19-20
• 3. 方法20-37
• 3.1 構建含有RNA干擾片段的AAV載體20-25
• 3.2 熒光定量PCR25-28
• 3.3 Western blot28-30
• 3.4 腺相關病毒的包裝30-33
• 3.5 狨猴后肢靜脈注射病毒33
• 3.6 活體熒光成像33-34
• 3.7 手術取少量肝臟組織34
• 3.8 冰凍切片免疫熒光34-35
• 3.9 石蠟切片免疫組化35-36
• 3.10 肝臟組織Western Blotting36-37
• 4 實驗結果37-48
• 4.1 腺相關病毒干擾載體構建37-39
• 4.2 細胞水平沉默效率的驗證39-42
• 4.3 病毒包裝42-43
• 4.4 病毒感染狨猴43-44
• 4.5 活體熒光成像44-45
• 4.6 肝臟組織P53基因沉默效率檢測45-48
• 討論48-51
• 總結51-52
• 參考文獻52-56
• 縮略詞56-58
• 個人信息58-59
• 致謝59-60

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