發(fā)布時(shí)間：2017-07-01 12:24

  本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化對(duì)斑馬魚gabrb2基因表達(dá)的調(diào)控：正常發(fā)育調(diào)控及在MET誘導(dǎo)構(gòu)建的精神分裂癥模型中的失調(diào)現(xiàn)象，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的精神分裂癥(Schizophrenia)是一種影響思維、感覺、心境和社會(huì)性的復(fù)雜而嚴(yán)重的精神疾病,多在青壯年緩慢或亞急性起病,全球發(fā)病率接近1%。臨床癥狀上由譬如幻覺、妄想、怪異行為的陽性癥狀,以及情感低落、快感缺乏、刻板思維、社交退縮等陰性癥狀構(gòu)成,并可伴有認(rèn)知功能損害癥狀。這些精神癥狀表現(xiàn)和神經(jīng)系統(tǒng)功能往往是難以分開的,比如γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能系統(tǒng)假說就認(rèn)為,精神分裂癥患者存在GABA能低下,精神分裂癥惡化可能是GABA遞質(zhì)逐步缺乏的表現(xiàn),且與精神分裂癥陰性癥狀和認(rèn)知損害癥狀相關(guān)。GABA是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),由谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸脫羧而合成,再經(jīng)囊泡釋放,激活突觸后神經(jīng)元細(xì)胞膜上的受體發(fā)揮作用,此外釋放于細(xì)胞間的遞質(zhì)還需要由GABA運(yùn)載體(GABA Transporter, GAT)及時(shí)再攝取,這整個(gè)過程稱為GABA能的傳遞。突觸后神經(jīng)元細(xì)胞膜上的GABA受體有A、B兩型,A型GABA受體屬于離子通道型受體,是由α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、ρ1-ρ3、π、ε、δ和0多個(gè)亞基組成的五聚體復(fù)合物,其中α1、β2、γ2亞基是構(gòu)成功能性受體的主要組分；介導(dǎo)GABA能快速突觸反應(yīng)。B型GABA受體屬于G-蛋白耦合受體,是由GABBR1和GABBR2組成的二聚體復(fù)合物；介導(dǎo)GABA能緩慢突觸反應(yīng)。在此GABA能的傳遞通路中,我們最關(guān)注的是編碼GABA (A)受體β2亞基的GABRB2基因,并已經(jīng)通過病例對(duì)照研究、細(xì)胞實(shí)驗(yàn),及小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了其DNA多態(tài)性、mRNA表達(dá)異常、蛋白受體功能受損以及表觀修飾異常都可能與精神分裂癥有關(guān)；該通路中的GAD1, GAD2基因同樣有著充足的精神分裂癥易感性證據(jù),三者均被收錄于SZgene論壇數(shù)據(jù)庫中；而GAT1基因作為編碼腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)GABA的GAT蛋白最主要的基因,也有部分與精神分裂癥相關(guān)的報(bào)道。精神分裂癥致病是由遺傳和環(huán)境因素共同起作用,并由表觀調(diào)控介導(dǎo)的。上述基因中,對(duì)GAD1基因的表觀調(diào)控研究相對(duì)較多,有小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表觀藥物甲硫氨酸(L-Methionine, MET)暴露可誘導(dǎo)產(chǎn)生精神分裂癥類似行為,并伴隨著RELN和GADl基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化改變,且通過組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸鈉(Valproate acid, VPA)干預(yù),在逆轉(zhuǎn)異常行為的同時(shí)降低了RELN的甲基化。而我們對(duì)GABRB2基因的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,在臨床精神分裂癥患者中,GABRB2基因內(nèi)含子8和9上的疾病相關(guān)SNP存在基因印跡現(xiàn)象,是精神分裂癥患者中出現(xiàn)基因型依賴性RNA表達(dá)降低的表觀調(diào)控機(jī)制；此外我們還發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者GABRB2基因啟動(dòng)子區(qū)存在顯著的高甲基化現(xiàn)象。斑馬魚是一種近年發(fā)展迅速的模式生物,與人類基因組高度同源,體型小、易養(yǎng)殖、易操作、易觀察,還具有類似人類的腦組織形態(tài)劃分,并存在著保守的精神行為調(diào)控機(jī)制,非常適合用于神經(jīng)精神疾病的研究。具體到GABA能系統(tǒng),斑馬魚作為脊椎動(dòng)物,亦以GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì),此外,有針對(duì)小腦的研究證實(shí)斑馬魚GABA能系統(tǒng),包括GAD蛋白和GABA受體的分布均與哺乳動(dòng)物一致,且GABA A受體同樣也可介導(dǎo)快速抑制性突觸傳遞。目前利用斑馬魚研究精神疾病最成功的例子是抑郁癥,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種方法建模及相對(duì)完整的行為學(xué)檢測(cè)體系,主要是新魚缸實(shí)驗(yàn),黑白箱實(shí)驗(yàn)加上其他實(shí)驗(yàn)；并可通過檢查壓力應(yīng)激軸(HPA軸)和5-HT系統(tǒng)通路的改變(即檢查皮質(zhì)醇和5-HT含量的改變)進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證；下一步便可以應(yīng)用該斑馬魚模型進(jìn)行抗抑郁藥物篩選工作了。而對(duì)于斑馬魚精神分裂癥建模,據(jù)我們了解,現(xiàn)有為數(shù)不多的研究都是應(yīng)用地卓西平馬來酸鹽(+MK-801)拮抗谷氨酸受體NMDA來進(jìn)行的。綜上所述,我們希望通過本研究揭示模式生物斑馬魚中g(shù)abrb2基因的發(fā)育生物學(xué)信息,尤其是甲基化調(diào)控信息；再利用表觀藥物MET暴露構(gòu)建斑馬魚精神分裂癥行為學(xué)模型,并系統(tǒng)檢測(cè)gabrb2基因(GABRB2同源基因)和其他聯(lián)系緊密的GABA能傳遞通路基因(gad1b, GAD1同源基因；gad2, GAD2同源基因；slc6a1b, GAT1同源基因)的甲基化及表達(dá)改變,以期對(duì)模型背后機(jī)制進(jìn)行解釋,并進(jìn)一步為精神分裂癥發(fā)生或發(fā)展的監(jiān)測(cè)、治療藥物的開發(fā)提供靶點(diǎn)。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本課題所用野生型AB系斑馬魚,全部由南方醫(yī)科大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室提供；其中,6-18月齡的成魚用于普通交配產(chǎn)卵；6-11月齡的成魚用于藥物處理及后續(xù)試驗(yàn),并使雌雄比例均衡。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)斑馬魚的飼養(yǎng)：斑馬魚飼養(yǎng)在專門的魚房中,參照Westerfield的方法進(jìn)行。重要參數(shù)如下：魚房晝夜光照周期為日：夜=14：10,反滲透凈水機(jī)制備的養(yǎng)魚系統(tǒng)水,保持pH值7.2-7.6,水溫28.5-29.5℃,電導(dǎo)率450-550μs/cm。(2)斑馬魚發(fā)育過程中甲基化圖譜的構(gòu)建：先進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切,再結(jié)合熒光偏振的方法(FPDM)檢測(cè)全基因組甲基化；結(jié)合熒光定量PCR的方法檢測(cè)gabrb2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化。(3)斑馬魚發(fā)育過程中g(shù)abrb2 mRNA表達(dá)圖譜的構(gòu)建：先提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA,再應(yīng)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)。(4)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育過程中g(shù)abrb2在腦組織內(nèi)的定位：先需設(shè)計(jì)構(gòu)建gabrb2基因的反義RNA探針,收集斑馬魚幾個(gè)重要神經(jīng)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的胚胎,以及6 dpf之前的幼魚,再使用整體原位雜交技術(shù)定位基因表達(dá)。(5)斑馬魚成魚藥物處理：采用浸泡給藥,所用表觀藥物MET參考Vuaden的實(shí)驗(yàn),并增加了一個(gè)濃度,最終以低中高三個(gè)濃度：1.5 mM,3.0 mM,6.0 mM,以及不加藥物的空白對(duì)照,連續(xù)處理7天,每天換藥。(6)斑馬魚行為學(xué)檢測(cè)：進(jìn)行了三種行為學(xué)實(shí)驗(yàn),包括檢測(cè)基本精神狀況及自發(fā)運(yùn)動(dòng)的新魚缸實(shí)驗(yàn)(Novel tank test),檢測(cè)社交行為檢測(cè)的社交趨避實(shí)驗(yàn)(Social interaction test),以及檢測(cè)認(rèn)知行為的T迷宮實(shí)驗(yàn)(T-maze tank test)。三種實(shí)驗(yàn)時(shí)間均需控制在當(dāng)日光照后的4.5-9小時(shí)內(nèi)進(jìn)行(13：00-18：00),實(shí)驗(yàn)開始前,先將受試魚轉(zhuǎn)移至行為學(xué)檢測(cè)所用場(chǎng)地,并給予受試魚30 min時(shí)間來適應(yīng)周圍環(huán)境。三種實(shí)驗(yàn)均采用先錄制后分析的方式,前兩種通過Etho Vision2.1軟件進(jìn)行分析,T迷宮實(shí)驗(yàn)則由培訓(xùn)過的研究人員通過盲法人為分析。(7)斑馬魚MET暴露后全基因組及GABA能傳遞相關(guān)基因的甲基化及mRNA表達(dá)分析：方法同發(fā)育過程中的相應(yīng)檢測(cè),但基因除了gabrb2再加上gad1b, gad2和slc6a1b。3.統(tǒng)計(jì)方法：斑馬魚發(fā)育過程中全基因組甲基化、gabrb2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和mRNA表達(dá)、新魚缸實(shí)驗(yàn)、MET處理后各基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化和mRNA表達(dá),依據(jù)方差齊性檢驗(yàn)選用方差分析(ANOVA)或布朗分析(Brown-Forsythe analysis),并相應(yīng)附以LSD或Dunnett T3的后檢驗(yàn)；社交趨避實(shí)驗(yàn)、T-迷宮實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；甲基化和表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；p值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.斑馬魚全基因組甲基化水平隨著發(fā)育而持續(xù)增加,尤其是8-16 hpf的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期,與0-4 hpf的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育準(zhǔn)備期相比,甲基化提升最明顯,約增加了一倍,之后甲基化水平基本穩(wěn)定,提升程度有限。2.斑馬魚gabrb2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平隨著發(fā)育而降低,檢測(cè)的兩個(gè)CCGG位點(diǎn)得到的結(jié)果均是如此,但距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)-1336 bp位置的CCGG變化更明顯。而斑馬魚gabrb2基因mRNA表達(dá)在發(fā)育初始有一短暫下調(diào),隨后持續(xù)升高,且成魚比幼魚要高很多,轉(zhuǎn)折點(diǎn)在16 hpf-24 hpf間,且明顯升高出現(xiàn)在2dpf后,即GABA能神經(jīng)元出現(xiàn),分泌GABA神經(jīng)遞質(zhì)后。3.整體原位雜交結(jié)果顯示gabrb2從24 hpf開始,隨著大腦形態(tài)分化,出現(xiàn)特異信號(hào),定位于前腦、中腦、中腦后腦邊界,2 dpf開始在后腦也出現(xiàn)表達(dá),且3 dpf-6 dpf斑馬魚大腦形態(tài)和gabrb2表達(dá)定位都非常穩(wěn)定。4.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,高劑量MET暴露誘發(fā)了斑馬魚社交障礙和學(xué)習(xí)記憶障礙,這是精神分裂癥的核心陰性癥狀和認(rèn)知損害癥狀的表現(xiàn)；并降低了斑馬魚的焦慮水平,但未改變其自發(fā)運(yùn)動(dòng)模式。5.MET暴露廣泛升高了全基因組和4個(gè)目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平,尤其是gabrb2-1336和gad1b-1397 CCGG位點(diǎn)。但即使是高劑量MET暴露,仍然未能引起GABA能傳遞系統(tǒng)4個(gè)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。6.相關(guān)分析顯示,斑馬魚發(fā)育過程中g(shù)abrb2 -1336 CCGG位點(diǎn)甲基化與其mRNA表達(dá)整體上呈負(fù)相關(guān)(尤其是經(jīng)過表達(dá)轉(zhuǎn)折點(diǎn)后),而MET暴露后相關(guān)性消失;gad1b-1397 CCGG位點(diǎn)甲基化受MET提升明顯,與其表達(dá)同樣不相關(guān)。結(jié)論1.發(fā)育過程中,斑馬魚gabrb2啟動(dòng)子區(qū)(尤其是-1336 CCGG位點(diǎn))甲基化總體上負(fù)向調(diào)控mRNA表達(dá),尤其是GABA能神經(jīng)元出現(xiàn)后。2.高濃度MET暴露能在野生型AB系斑馬魚中模擬精神分裂癥陰性癥狀和認(rèn)知損害癥狀,以此構(gòu)建精神分裂癥模型。3.gabrb2及gad1b的表觀失調(diào)(主要表現(xiàn)在gabrb2-1336 CCGG位點(diǎn)和gnd1b-1397 CCGG位點(diǎn)的甲基化失調(diào)),加上各GABA能傳遞相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化,可能共同引起精神分裂癥的陰性癥狀和認(rèn)知損害癥狀發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：精神分裂癥 斑馬魚 行為學(xué) 甲基化 gabrb2 甲硫氨酸
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.3;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第1章 引言16-27
• 1.1 精神分裂癥的神經(jīng)遞質(zhì)假說17-19
• 1.2 GABA能系統(tǒng)的研究背景19-21
• 1.3 DNA甲基化與精神分裂癥表觀動(dòng)物模型的研究背景21-22
• 1.4 利用斑馬魚研究GABA能系統(tǒng)及精神分裂癥行為的可行性22-26
• 1.5 本研究的目的26-27
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料27-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物27
• 2.2 主要試劑27-28
• 2.3 主要儀器28-29
• 2.4 主要溶液配制29-31
• 2.5 分析軟件31-32
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法32-50
• 3.1 技術(shù)路線32-33
• 3.2 斑馬魚的飼養(yǎng)33
• 3.3 斑馬魚的集卵33
• 3.4 整體原位雜交(Whole mount in situ hybridization,WISH)33-41
• 3.5 藥物處理(暴露)41
• 3.6 行為學(xué)檢測(cè)41-44
• 3.7 酚/氯仿法DNA提取44
• 3.8 Trizol法RNA提取44-45
• 3.9 甲基化檢測(cè)45-48
• 3.10 mRNA表達(dá)檢測(cè)48
• 3.11 統(tǒng)計(jì)方法48-50
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-65
• 4.1 斑馬魚發(fā)育過程中全基因組和gabrb2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖譜50-52
• 4.2 斑馬魚發(fā)育過程中g(shù)abrb2的mRNA表達(dá)圖譜52-53
• 4.3 MET暴露對(duì)斑馬魚精神行為的影響53-56
• 4.4 MET暴露對(duì)斑馬魚全基因組和GABA能傳遞相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響56-58
• 4.5 MET暴露對(duì)斑馬魚GABA能傳遞相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響58
• 4.6 gabrb2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與mRNA的表達(dá)的相關(guān)性分析58-65
• 第5章 討論分析65-71
• 5.1 斑馬魚發(fā)育過程中全基因組甲基化是持續(xù)增高的65
• 5.2 斑馬魚發(fā)育過程中g(shù)abrb2的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控65-66
• 5.3 斑馬魚發(fā)育過程中g(shù)abrb2表達(dá)的先減再增是為了適應(yīng)與GABA遞質(zhì)的比例,以保障GABA能系統(tǒng)正常功能的行使66-67
• 5.4 MET暴露可誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生精神分裂癥模擬陰性癥狀和認(rèn)知損害癥狀,用于構(gòu)建精神分裂癥模型67-68
• 5.5 MET暴露破壞了斑馬魚 gabrb2及gad1b正常表觀調(diào)控,廣泛升高GABA能系統(tǒng)各基因甲基化,與精神分裂癥樣陰性和認(rèn)知損害癥狀有關(guān)68-69
• 5.6 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)、不足與展望69-71
• 第6章 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-79
• 攻讀學(xué)位期間成果79-80
• 致謝80-82

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本文編號(hào)：505953