本文關(guān)鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)與免疫保護(hù)作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)MERS-Co V S1和RBD蛋白,明確其作為重組疫苗靶抗原的免疫原性和誘導(dǎo)中和抗體的能力;利用制備的S1重組蛋白篩選制備具有中和活性的抗MERS-Co V單克隆抗體。方法:(1)構(gòu)建含有MERS-Co V S1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒,感染Sf9細(xì)胞,收獲感染上清,通過鎳離子親和層析純化獲得S1重組蛋白。利用純化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平;通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。同時(shí)利用重組表達(dá)S1蛋白免疫BALB/c小鼠,將免疫后小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,通過ELISA篩選出陽性克隆,隨后通過多次亞克隆篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,制備單抗腹水并進(jìn)行抗體效價(jià)測定及亞類鑒定;通過MERS-Co V假病毒及活病毒中和試驗(yàn)篩選出中和單抗。(2)利用生物信息學(xué)方法對MERS-Co V S1基因序列、二級結(jié)構(gòu)、柔性分析;同時(shí)對MERS-Co V RBD、MERS-Co V單克隆抗體及MERS-Co V RBD與細(xì)胞受體DPP4結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測在S1內(nèi)部具有免疫保護(hù)功能區(qū)段355-590aa;針對預(yù)測的免疫功能保護(hù)區(qū)設(shè)計(jì)添加foldon序列,構(gòu)建含有MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒進(jìn)而感染Sf9細(xì)胞,收獲感染上清,通過鎳離子親和層析純化獲得RBD、RBDFd重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平;通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。結(jié)果:(1)獲得了表達(dá)MERS-Co V S1蛋白的重組病毒株,并在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)和純化了分子量約140k D S1重組蛋白。利用重組表達(dá)的S1蛋白免疫小鼠三次,血清S1特異性Ig G抗體滴度可達(dá)1:102400;免疫小鼠血清稀釋5120倍后中和百分比仍能達(dá)到50%以上,且具有良好的活病毒中和活性。(2)利用重組的MERS-Co V S1蛋白篩選獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株。制備的腹水單抗亞類為6株為Ig G1型,2株為Ig G2a型,2株為Ig M型;10株單抗抗體ELISA效價(jià)達(dá)到10000以上,并獲得1株單抗對MERS-Co V具有良好的中和活性。(3)獲得了表達(dá)MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd蛋白的重組病毒株,在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)并純化了分子量約40k D MERS-Co V RBD單體重組蛋白以及分子量約100k D MERS-Co V RBDFd寡聚體蛋白。利用重組表達(dá)的RBD單體蛋白免疫小鼠三次,血清MERS-Co V RBD特異性Ig G抗體滴度可達(dá)1:6400;免疫小鼠血清稀釋3200倍后中和百分比低于50%,對MERS-Co V假病毒的中和活性較弱。而利用形成寡聚體的RBD蛋白在一次加強(qiáng)免疫后,血清中MERS-Co V RBDFd特異性Ig G抗體滴度可達(dá)1:102400;免疫小鼠血清稀釋12800倍后中和百分比仍高于50%。結(jié)論:利用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度保護(hù)性中和抗體,篩選制備出一株具有良好中和活性的MERS-Co V單克隆抗體。重組表達(dá)的MERS-Co V RBD單體蛋白免疫原性以及對假病毒中和活性都較弱;利用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的MERS-Co V RBDFd寡聚體重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度中和抗體,對MERS-Co V假病毒以及活病毒都具有很好的中和活性。該研究為發(fā)展一種安全有效的針對MERS-Co V的預(yù)防疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖35幅,表4個(gè)。參考文獻(xiàn)57篇。
【關(guān)鍵詞】：MERS病毒 受體結(jié)合區(qū) 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 符號說明11-12
• 1 前言12-16
• 2.MERS病毒S1蛋白重組表達(dá)及抗S1蛋白單克隆抗體的制備16-31
• 2.1 材料與方法16-22
• 2.2 結(jié)果22-29
• 2.2.1 MERS病毒S1蛋白在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)及鑒定22-24
• 2.2.2 MERS病毒S1重組蛋白免疫原性及免疫反應(yīng)特征分析24-26
• 2.2.3 MERS病毒S1重組蛋白免疫小鼠血清抗體中和活性檢測26
• 2.2.4 抗MERS病毒S1單克隆抗體的制備及鑒定26-29
• 2.3 討論29-31
• 3 MERS病毒RBD蛋白在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)及免疫保護(hù)作用分析31-50
• 3.1 材料與方法31-36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-47
• 3.2.1 MERS病毒RBD重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)與鑒定36-42
• 3.2.2 MERS病毒RBD重組蛋白抗原性及免疫反應(yīng)特征分析42-43
• 3.2.3 MERS病毒RBD重組蛋白免疫小鼠血清抗體活病毒中和活性分析43-44
• 3.2.4 SARS病毒RBD與MERS病毒RBD交叉反應(yīng)性以及交叉中和活性的比較44-47
• 3.3 討論47-50
• 4. 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附錄55-61
• 攻讀碩士期間研究成果61-62
• 簡歷62-63
• 致謝63-65
• 綜述65-74
• 參考文獻(xiàn)72-74

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李文青，肖成祖;昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)[J];生物技術(shù);1995年01期

2 金立杰，薛偉鋼，張士安;有效凍存昆蟲細(xì)胞的新方法[J];生物技術(shù);1996年03期

3 宋德偉,馬艷,馮穎,陳曉鳴;昆蟲細(xì)胞工程研究進(jìn)展[J];林業(yè)科學(xué)研究;2004年01期

4 李守信,李長友,鄭桂玲,周洪旭,吳文君,李國勛;昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2005年03期

5 張佑紅;朱雄偉;陳燕;;昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用進(jìn)展[J];武漢化工學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期

6 楊青;劉建茹;張曉丹;張志強(qiáng);馮立;張麗華;張玉奎;;用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人組織激肽釋放酶原[J];生物技術(shù);2006年06期

7 張寰;張永安;秦啟聯(lián);王玉珠;曲良建;李tD;苗麟;殷珍仙;張愛君;溫發(fā)園;;昆蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)和建立技術(shù)[J];昆蟲學(xué)報(bào);2007年08期

8 黎路林，陳曲侯;一種貯存昆蟲細(xì)胞系的簡便方法[J];華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1995年04期

9 朱遐;用于生產(chǎn)生物制劑的昆蟲細(xì)胞[J];生物技術(shù)通報(bào);1996年03期

10 趙佼,譚文松,周亞競,張虹華,俞俊棠;一種確定轉(zhuǎn)瓶中昆蟲細(xì)胞攝氧率的簡便方法[J];華東理工大學(xué)學(xué)報(bào);1997年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李元杰;李君浩;;昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及其在農(nóng)藥研究開發(fā)中的應(yīng)用[A];華中昆蟲研究（第6卷）[C];2010年

2 諶立偉;高燦;周德和;池志強(qiáng);;表達(dá)在昆蟲細(xì)胞上人μ阿片受體的二聚化作用[A];中國藥理學(xué)會第十屆全國神經(jīng)學(xué)術(shù)會議暨浙江省藥理學(xué)會2002年年會論文摘要集[C];2002年

3 陳彥;劉玉平;吳志聰;白楊;戴仁科;;人葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1、1A6、1A9、2B7和2B11在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其代謝活性研究[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

4 李國勛;李長友;;昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)與生物技術(shù)研究進(jìn)展[A];中國微生物學(xué)會《第二屆全國農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會》和《第十一屆全國殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會》暨《湖北省暨武漢市微生物學(xué)會和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會2008年會》論文摘要[C];2008年

5 靖志強(qiáng);張佑紅;;重組桿狀病毒感染懸浮昆蟲細(xì)胞感染策略優(yōu)化及放大試驗(yàn)[A];2009’環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品暨生物農(nóng)藥技術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 余澤華;劉冬連;陳曲候;;昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究[A];全國生物防治學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];1995年

7 張佑紅;朱雄偉;;昆蟲細(xì)胞感染在低感染復(fù)數(shù)下的動力學(xué)[A];湖北省生物工程學(xué)會2004年年會學(xué)術(shù)報(bào)告及論文摘要匯編[C];2004年

8 馬艷;丁偉峰;馮穎;張欣;馬濤;;不同冷凍保護(hù)劑和凍存時(shí)間對昆蟲細(xì)胞系NIAS-MaBr-85凍存后細(xì)胞活力的影響[A];云南省昆蟲學(xué)會2009年年會論文集[C];2009年

9 葉林柏;郜金榮;;HCMVpol基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)、酶的純化和生化性質(zhì)[A];全國生物防治學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];1995年

10 梁偉峰;朱國獻(xiàn);朱函坪;姚蘋蘋;朱智勇;;漢坦病毒G2糖蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其應(yīng)用[A];第七次全國腎綜合征出血熱學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

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1 張欣;昆蟲細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性與應(yīng)用研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2011年

2 王彥彬;豬干擾素a和γ在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)及重組蛋白初步應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

3 薛萍;角質(zhì)細(xì)胞生長因子-1（KGF-1）在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 徐侃彥;AVP(4-8)調(diào)控基因的新途徑研究及大鼠CCTβ在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2002年

5 林董;RSV五個(gè)基因及GFP-CP、GFP-SP融合基因在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2007年

6 齊影;戊型肝炎病毒（HEV）組成和結(jié)構(gòu)的分析及其ORF2蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2015年

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1 潘婷;中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)與免疫保護(hù)作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 宋德偉;昆蟲細(xì)胞的建庫技術(shù)研究及昆蟲細(xì)胞的原代培養(yǎng)[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2004年

3 李守信;轉(zhuǎn)p～（35）基因昆蟲細(xì)胞系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

4 李玲;豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)分析及病毒衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

5 邱平明;人ZP3嵌合肽在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其活性研究[D];暨南大學(xué);2004年

6 張欣;兩種鞘翅目昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及昆蟲細(xì)胞系染色體分析[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2006年

7 許雪蓮;利用桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)人細(xì)胞色素P450 2C9酶[D];吉林大學(xué);2008年

8 王振亞;雞干擾素α、γ在昆蟲細(xì)胞中的共表達(dá)[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 張茹君;重組桿狀病毒介導(dǎo)的人組織激肽釋放酶在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[D];揚(yáng)州大學(xué);2009年

10 師文娟;人Ⅱ型CD74及人源與瘧原蟲來源MIF在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)與免疫保護(hù)作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：496248