本文關(guān)鍵詞：粉塵螨1類變應(yīng)原T和B細胞表位嵌合基因的構(gòu)建、表達及特異性免疫治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：構(gòu)建編碼粉塵螨1類變應(yīng)原(Derfl) B的細胞表位與T細胞表位嵌合基因原核表達載體,并進行大規(guī)模表達純化,以及探究重組變應(yīng)原的特異性免疫治療(Allergen Specific Immunotherapy, ASIT)效果。 方法1)將Derf1所包含的5個T細胞表位(T1-T5)與6個B細胞表位(B1～B6),按照B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5連接方式,直接合成表位嵌合基因,并分別命名為Derf1A和Derf1B。構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Derf1A和pET-28a(+)-Derf1B,通過經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I/Xho I進行雙酶切鑒定,并在測序驗證的陽性后,克隆轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE分析各表達的產(chǎn)物并純化,同時利用Western bloting進行鑒定驗證。ELISA檢測法檢測各表達的嵌合蛋白對粉塵螨過敏患者的血清IgE抗體的結(jié)合力。2)動物實驗：把50只小鼠隨機分為：A組：陰性對照組、B組：哮喘組、C組：Derf1治療組、D組：重組融合變應(yīng)原Derf1B治療組、E組：重組融合變應(yīng)原Derf1A治療組等5組。其中哮喘組、Derf1治療組、Derf1B治療組和Derf1A治療組小鼠用粉塵螨提取液于第1、7、14d進行3次腹腔注射致敏,并于第21d開始行霧化吸入激發(fā),持續(xù)7d。其中治療組于霧化吸入前30分鐘,分別用Derf1、Der f1B、Derf1A進行特異性免疫治療。對照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行腹腔注射及霧化吸入。完成霧化吸入激發(fā)實驗后,分別進行：1計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)：2觀察肺組織病理切片；3檢測BALF與脾細胞培養(yǎng)上清液(SSCS)中IL-5、IFN-γ;4血清中特異性IgE、IgG2a水平。 結(jié)果雙酶切及測序的結(jié)果表明,成功構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Der f1A與pET-28a(+)-Der f1B; SDS-PAGE分析表明,Derf1A與Der f1B成功誘導(dǎo),并純化成功。Western blotting的結(jié)果進一步證實純化了Der f1A和Derf1B的嵌合蛋白。同時進行了大規(guī)模的純化。與Derf1目比,發(fā)現(xiàn)Der f1A-與Derf1B嵌合蛋白和粉塵螨過敏患者的血清IgE抗體的結(jié)合能力顯著降低(P0.01),但是Derf1A與Derf1B之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。用Der f1A和Derf1B嵌合蛋白分別對粉塵螨粗提取液致敏的小鼠哮喘模型進行特異性免疫治療后,經(jīng)ELISA法檢測,結(jié)果表明：Derf1組、Derf1A和Derf1B組小鼠的肺部炎癥比哮喘組明顯減輕。Derf1組、Derf1A與Derf1B組小鼠肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)均明顯降低,但Derf1組與Derf1A組、Derf1B組相比,沒有明顯的差異(P0.05)。ELISA法檢測的各組小鼠SSCS與BALF中的IFN-γ與IL-5水平,結(jié)果顯示：Derf1組、Derf1A組、Derf1B組和哮喘組比較,SSCS和BALF中IFN-γ含量則顯著升高(P0.01),IL-5的水平明顯降低(P0.01),Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Derf1組、Derf1A組、Derf1B組血清中變應(yīng)原特異性IgE抗體的濃度降低顯著(P0.01),Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。IgG2a濃度則顯著升高(P0.01), Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論成功表達了Derfl的B和T細胞的表位嵌合蛋白,同時進行了大規(guī)模純化；所表達的嵌合蛋白成功通過對塵螨過敏性哮喘模型的小鼠進行治療,且在一定程度上可有效減輕哮喘模型的小鼠的肺部炎癥。粉塵螨1類變應(yīng)原的小分子低毒過敏原構(gòu)建成功,為診斷和治療過敏性哮喘奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：塵螨1類變應(yīng)原 重組變應(yīng)原 特異性免疫治療 T細胞表位 B細胞表位
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R384.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注釋說明清單13-17
• 引言17-20
• 第一部分 粉塵螨1類變應(yīng)原T與B細胞表位嵌合基因的構(gòu)建與表達20-46
• 1 研究內(nèi)容20-21
• 1.1 基因合成20
• 1.2 設(shè)計引物20-21
• 2 材料與方法21-28
• 2.1 主要試劑21-23
• 2.2 主要試劑配置23-28
• 3 實驗方法28-37
• 3.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建28
• 3.2 重組質(zhì)粒的提取28-29
• 3.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定29-30
• 3.4 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化30
• 3.5 菌落PCR、篩選陽性菌及測序30-31
• 3.6 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的小量誘導(dǎo)表達31
• 3.7 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析31-33
• 3.8 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的大量誘導(dǎo)表達33
• 3.9 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的純化及鑒定33-34
• 3.10 純化產(chǎn)物的免疫印記(western blot)分析34
• 3.11 Bradford's法定量蛋白濃度34-37
• 4 結(jié)果37-44
• 4.1 重組融合表位基因Derf1A、Derf1B的PCR擴增37-38
• 4.2 重組質(zhì)粒鑒定38-39
• 4.3 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析39-41
• 4.4 Derf1,Derf1A,Derf1B重組蛋白的純化41-42
• 4.5 純化產(chǎn)物的免疫印跡(Western blot)鑒定42-43
• 4.6 重組蛋白的濃度測定43
• 4.7 Derf1B與Derf1A對粉塵螨過敏患者的血清IgE結(jié)合力43-44
• 討論44-46
• 第二部分 Derf1A、Derf1B嵌合蛋白對哮喘小鼠免疫治療的效果分析46-59
• 1 研究內(nèi)容46-47
• 2 材料與方法47-48
• 2.1 材料與試劑47
• 2.2 實驗材料47
• 2.3 主要試劑47
• 2.4 主要試劑配制47-48
• 3 實驗步驟48-51
• 3.1 實驗動物分組48
• 3.2 建立哮喘小鼠模型48-49
• 3.3 特異性免疫治療49
• 3.4 實驗標本取材及指標檢測49-50
• 3.4.1 血清特異性IgE和IgG2a抗體含量的測定49
• 3.4.2 脾細胞培養(yǎng)49-50
• 3.4.3 肺組織切片HE染色50
• 3.4.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中特異性細胞因子檢測50
• 3.5 統(tǒng)計學(xué)方法50-51
• 4 結(jié)果51-57
• 4.1 各組小鼠癥狀與體征的改變51
• 4.2 ELISA法測定血清中特異性IgE和IgG2a的含量51-52
• 4.3 ELISA法測定小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液中抗原特異性IL-5和IFN-γ的含量52-54
• 4.4 肺組織切片HE染色54
• 4.5 ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中特異性細胞因子IL-5和IFN-γ的含量54-55
• 4.6 BALF中細胞分類計數(shù)55-57
• 5 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-67
• 致謝67-69
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果69

【參考文獻】

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本文編號：485637