本文關(guān)鍵詞：粉塵螨1類變應(yīng)原T和B細(xì)胞表位嵌合基因的構(gòu)建、表達(dá)及特異性免疫治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：構(gòu)建編碼粉塵螨1類變應(yīng)原(Derfl) B的細(xì)胞表位與T細(xì)胞表位嵌合基因原核表達(dá)載體,并進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)純化,以及探究重組變應(yīng)原的特異性免疫治療(Allergen Specific Immunotherapy, ASIT)效果。 方法1)將Derf1所包含的5個T細(xì)胞表位(T1-T5)與6個B細(xì)胞表位(B1～B6),按照B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5連接方式,直接合成表位嵌合基因,并分別命名為Derf1A和Derf1B。構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Derf1A和pET-28a(+)-Derf1B,通過經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I/Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定,并在測序驗(yàn)證的陽性后,克隆轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析各表達(dá)的產(chǎn)物并純化,同時利用Western bloting進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。ELISA檢測法檢測各表達(dá)的嵌合蛋白對粉塵螨過敏患者的血清IgE抗體的結(jié)合力。2)動物實(shí)驗(yàn)：把50只小鼠隨機(jī)分為：A組：陰性對照組、B組：哮喘組、C組：Derf1治療組、D組：重組融合變應(yīng)原Derf1B治療組、E組：重組融合變應(yīng)原Derf1A治療組等5組。其中哮喘組、Derf1治療組、Derf1B治療組和Derf1A治療組小鼠用粉塵螨提取液于第1、7、14d進(jìn)行3次腹腔注射致敏,并于第21d開始行霧化吸入激發(fā),持續(xù)7d。其中治療組于霧化吸入前30分鐘,分別用Derf1、Der f1B、Derf1A進(jìn)行特異性免疫治療。對照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。完成霧化吸入激發(fā)實(shí)驗(yàn)后,分別進(jìn)行：1計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)：2觀察肺組織病理切片；3檢測BALF與脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液(SSCS)中IL-5、IFN-γ;4血清中特異性IgE、IgG2a水平。 結(jié)果雙酶切及測序的結(jié)果表明,成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Der f1A與pET-28a(+)-Der f1B; SDS-PAGE分析表明,Derf1A與Der f1B成功誘導(dǎo),并純化成功。Western blotting的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)純化了Der f1A和Derf1B的嵌合蛋白。同時進(jìn)行了大規(guī)模的純化。與Derf1目比,發(fā)現(xiàn)Der f1A-與Derf1B嵌合蛋白和粉塵螨過敏患者的血清IgE抗體的結(jié)合能力顯著降低(P0.01),但是Derf1A與Derf1B之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用Der f1A和Derf1B嵌合蛋白分別對粉塵螨粗提取液致敏的小鼠哮喘模型進(jìn)行特異性免疫治療后,經(jīng)ELISA法檢測,結(jié)果表明：Derf1組、Derf1A和Derf1B組小鼠的肺部炎癥比哮喘組明顯減輕。Derf1組、Derf1A與Derf1B組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均明顯降低,但Derf1組與Derf1A組、Derf1B組相比,沒有明顯的差異(P0.05)。ELISA法檢測的各組小鼠SSCS與BALF中的IFN-γ與IL-5水平,結(jié)果顯示：Derf1組、Derf1A組、Derf1B組和哮喘組比較,SSCS和BALF中IFN-γ含量則顯著升高(P0.01),IL-5的水平明顯降低(P0.01),Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Derf1組、Derf1A組、Derf1B組血清中變應(yīng)原特異性IgE抗體的濃度降低顯著(P0.01),Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。IgG2a濃度則顯著升高(P0.01), Derf1組、Derf1A組、Derf1B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論成功表達(dá)了Derfl的B和T細(xì)胞的表位嵌合蛋白,同時進(jìn)行了大規(guī)模純化；所表達(dá)的嵌合蛋白成功通過對塵螨過敏性哮喘模型的小鼠進(jìn)行治療,且在一定程度上可有效減輕哮喘模型的小鼠的肺部炎癥。粉塵螨1類變應(yīng)原的小分子低毒過敏原構(gòu)建成功,為診斷和治療過敏性哮喘奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：塵螨1類變應(yīng)原 重組變應(yīng)原 特異性免疫治療 T細(xì)胞表位 B細(xì)胞表位
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R384.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注釋說明清單13-17
• 引言17-20
• 第一部分 粉塵螨1類變應(yīng)原T與B細(xì)胞表位嵌合基因的構(gòu)建與表達(dá)20-46
• 1 研究內(nèi)容20-21
• 1.1 基因合成20
• 1.2 設(shè)計(jì)引物20-21
• 2 材料與方法21-28
• 2.1 主要試劑21-23
• 2.2 主要試劑配置23-28
• 3 實(shí)驗(yàn)方法28-37
• 3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建28
• 3.2 重組質(zhì)粒的提取28-29
• 3.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定29-30
• 3.4 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化30
• 3.5 菌落PCR、篩選陽性菌及測序30-31
• 3.6 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)31
• 3.7 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析31-33
• 3.8 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)33
• 3.9 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的純化及鑒定33-34
• 3.10 純化產(chǎn)物的免疫印記(western blot)分析34
• 3.11 Bradford's法定量蛋白濃度34-37
• 4 結(jié)果37-44
• 4.1 重組融合表位基因Derf1A、Derf1B的PCR擴(kuò)增37-38
• 4.2 重組質(zhì)粒鑒定38-39
• 4.3 Derf1,Derf1A,Derf1B蛋白的SDS-PAGE分析39-41
• 4.4 Derf1,Derf1A,Derf1B重組蛋白的純化41-42
• 4.5 純化產(chǎn)物的免疫印跡(Western blot)鑒定42-43
• 4.6 重組蛋白的濃度測定43
• 4.7 Derf1B與Derf1A對粉塵螨過敏患者的血清IgE結(jié)合力43-44
• 討論44-46
• 第二部分 Derf1A、Derf1B嵌合蛋白對哮喘小鼠免疫治療的效果分析46-59
• 1 研究內(nèi)容46-47
• 2 材料與方法47-48
• 2.1 材料與試劑47
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料47
• 2.3 主要試劑47
• 2.4 主要試劑配制47-48
• 3 實(shí)驗(yàn)步驟48-51
• 3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組48
• 3.2 建立哮喘小鼠模型48-49
• 3.3 特異性免疫治療49
• 3.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材及指標(biāo)檢測49-50
• 3.4.1 血清特異性IgE和IgG2a抗體含量的測定49
• 3.4.2 脾細(xì)胞培養(yǎng)49-50
• 3.4.3 肺組織切片HE染色50
• 3.4.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中特異性細(xì)胞因子檢測50
• 3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法50-51
• 4 結(jié)果51-57
• 4.1 各組小鼠癥狀與體征的改變51
• 4.2 ELISA法測定血清中特異性IgE和IgG2a的含量51-52
• 4.3 ELISA法測定小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗原特異性IL-5和IFN-γ的含量52-54
• 4.4 肺組織切片HE染色54
• 4.5 ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中特異性細(xì)胞因子IL-5和IFN-γ的含量54-55
• 4.6 BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)55-57
• 5 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 致謝67-69
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：485637