本文關(guān)鍵詞：Ikaros家族蛋白異源表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性疾病,目前在我國(guó)具有較高的發(fā)病率和死亡率,而且發(fā)病率還在不斷攀升,因此與白血病發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制的研究備受關(guān)注。Ikaros家族蛋白是主要分布在血細(xì)胞中的一類轉(zhuǎn)錄因子蛋白,可調(diào)控血細(xì)胞分化發(fā)育中多種重要基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),對(duì)多種血細(xì)胞,尤其是淋巴系白細(xì)胞的發(fā)育有著重要影響。它們的表達(dá)或功能異常與多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤高度相關(guān)。Ikaros家族蛋白的N端和C端各具有一組C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域：N端部分的四個(gè)鋅指主要負(fù)責(zé)結(jié)合特定的DNA序列；而C端的兩個(gè)鋅指參與介導(dǎo)蛋白蛋白之間的相互作用,并對(duì)N端功能和蛋白壽命起到一定的調(diào)控作用。Ikaros家族蛋白可以從染色體、核小體、RNA聚合酶三個(gè)層面,通過(guò)直接結(jié)合目的基因的調(diào)控元件、招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物以及將目的基因調(diào)控區(qū)域募集至細(xì)胞核異染色質(zhì)區(qū)域等方式,調(diào)控下游蛋白的轉(zhuǎn)錄。其中,C端鋅指介導(dǎo)的蛋白蛋白相互作用對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的完成起重要作用。本論文選取該家族的Ikaros 和 Aiolos的C端保守部分作為研究對(duì)象,進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)、純化及初步的晶體學(xué)研究。已獲得的研究結(jié)果包括：1.通過(guò)分子克隆的方法成功構(gòu)建了多種表達(dá)質(zhì)粒。在原核系統(tǒng)中,質(zhì)粒攜帶的編碼基因能夠表達(dá)出含有不同長(zhǎng)度柔性連接區(qū)域的MBP融合蛋白,且經(jīng)酶切驗(yàn)證,各融合蛋白呈現(xiàn)不同的酶切效果；2.根據(jù)目的蛋白的特異標(biāo)簽親和性、表面電荷、疏水性、分子量及分子形狀等特征,采取不同的層析方式分別對(duì)4BP-IkarosC/AiolosC 及 Ikaros/Aiolos的C端蛋白進(jìn)行分離純化,獲得了大量高純度的MBP-IkarosC/AiolosC融合蛋白；3.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明Ikaros/Aiolos 的 C端蛋白可能與層析填料基質(zhì)發(fā)生相互作用,導(dǎo)致目的蛋白難于洗脫純化；4.針對(duì)MBP-IkarosC/AiolosC篩選得到多個(gè)潛在的晶體生長(zhǎng)條件,完成初步條件優(yōu)化,可重復(fù)性很強(qiáng),目前實(shí)驗(yàn)仍在繼續(xù)進(jìn)行中。論文的另一部分對(duì)雙孔鉀離子通道TREK1進(jìn)行了研究。該蛋白主要分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中。TREK1屬于機(jī)械門控性鉀離子通道,同時(shí)受到化學(xué)或生理性刺激,包括脂質(zhì)、磷酸化、溫度、pH值等多種因素的調(diào)節(jié)。它在體內(nèi)具有重要的生理意義,與神經(jīng)保護(hù)、疼痛、麻醉、抑郁癥等具有一定的相關(guān)性。哺乳動(dòng)物雙孔鉀離子通道TREK1亞群以二聚的形式發(fā)揮功能,其單體具有典型的結(jié)構(gòu)特征：4個(gè)跨膜片段(M1～M4),2個(gè)孔道區(qū)域(2P),胞漿內(nèi)側(cè)有較短的氨基端和較長(zhǎng)的羧基端。有報(bào)道稱,TREK1 C端部分是各種因素調(diào)控TREK1活性的一個(gè)重要部位。本論文以TREK1的C端蛋白部分作為研究對(duì)象,進(jìn)行了一系列分子克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)。目前,利用pET28a、pET30a、pMAL、pFN18α等載體,分別連接不同長(zhǎng)度TREK1C截短片段的編碼基因,已成功構(gòu)建11種表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn),篩選出表達(dá)較好且融合蛋白可溶性較高的pMAL-TREK1C質(zhì)粒進(jìn)行大量表達(dá)。選用MBP親和層析及分子篩對(duì)MBP-TREK1C進(jìn)行分離純化,最終得到足量且純度較高的融合蛋白。使用Index及Wizard兩種結(jié)晶試劑盒進(jìn)行晶體條件的初步篩選,結(jié)果尚在觀察中。
【關(guān)鍵詞】：Ikaros 鋅指 TREK1 蛋白表達(dá)純化
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-15
• 文獻(xiàn)綜述15-38
• References29-38
• 實(shí)驗(yàn)材料38-47
• 實(shí)驗(yàn)方法47-60
• 1. 目的片段的獲得47-49
• 2. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及驗(yàn)證49-52
• 3. 重組質(zhì)粒突變及驗(yàn)證52-53
• 4. 目的蛋白的表達(dá)純化53-58
• 5. 蛋白結(jié)晶58-60
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-94
• 1. 含MBP標(biāo)簽的Ikaros/AiolosC質(zhì)粒構(gòu)建、純化及結(jié)晶試驗(yàn)60-69
• 2. 不含MBP標(biāo)簽的Ikaros/AiolosC質(zhì)粒構(gòu)建及純化試驗(yàn)69-85
• 3. TREK1C質(zhì)粒構(gòu)建、純化及結(jié)晶試驗(yàn)85-94
• 總結(jié)與討論94-98
• 參考文獻(xiàn)98-100
• 致謝100-101
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在校期間的科研成果101-102

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3 柳萍;IKAROS家族調(diào)控蛋白在成人白血病中的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：Ikaros家族蛋白異源表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：476061