本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲529 bp重復(fù)序列環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的建立高效檢測剛地弓形蟲(Toxoplama gondii)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法,為弓形蟲病診斷提供新的技術(shù)手段。方法采用在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計弓形蟲529 bp基因LAMP擴增引物,用已構(gòu)建的pMD-19T-529 bp重組質(zhì)粒為模板,建立LAMP擴增反應(yīng),通過添加環(huán)引物、設(shè)置不同濃度的甜菜堿和Mg SO_4以及不同反應(yīng)溫度對擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化。以豬、微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、豬等孢球蟲(Isospora suis)的基因組DNA和超純水為對照,pMD-19T-529 bp重組質(zhì)粒為模板,分別進行優(yōu)化后的LAMP和PCR擴增,評價LAMP方法的特異性。將pMD-19T-529 bp重組質(zhì)粒梯度稀釋為109~100copies/ml,分別進行優(yōu)化后的LAMP和PCR擴增,評價LAMP方法的靈敏性。結(jié)果設(shè)計的LAMP擴增引物可擴增出弓形蟲529 bp序列保守區(qū)域的目的片段。優(yōu)化結(jié)果顯示,最佳反應(yīng)總體系為25μl,其中,甜菜堿最佳濃度為0.4 mol/L,Mg SO_4最佳濃度為6 mmol/L;添加環(huán)引物反應(yīng)30 min的擴增效率與未添加環(huán)引物反應(yīng)60 min的擴增效率相當(dāng),可使反應(yīng)時間縮短30 min;最佳反應(yīng)條件為63℃30 min,80℃3 min。特異性檢測結(jié)果顯示,所建立的LAMP方法可特異擴增弓形蟲529 bp基因片段,對照均未擴增出目的片段。靈敏性檢測結(jié)果顯示,LAMP方法的最低檢出值達10~3 copies/ml,效率為PCR擴增(10~4 copies/ml)的10倍。結(jié)論建立了弓形蟲529 bp重復(fù)序列的LAMP檢測方法,該法具有較好的特異性和靈敏性。
【作者單位】： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所;
【關(guān)鍵詞】： 剛地弓形蟲 bp重復(fù)序列 環(huán)介導(dǎo)擴增 建立
【基金】：安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金(No.030870360)~~
【分類號】：R382.5
【正文快照】： (1 College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,ChineseAcademy of Agricultural Science,Lanzhou 730046,China)作者單

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