本文關鍵詞：旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構建及其誘導的免疫保護，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：旋毛蟲病是一種幾乎呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病,主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的豬肉而感染。目前對旋毛蟲病尚無有效的預防疫苗和控制方法。因此,世界各國每年投入大量人力、物力及財力用于動物肉類中旋毛蟲的檢疫與獸用疫苗的研究,希望阻斷旋毛蟲病由動物向人類的傳播。近年來,感染性疾病的預防性DNA疫苗和腫瘤的治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快。DNA疫苗在接種后,其免疫和病毒的自然感染過程相似,促進黏膜免疫的發(fā)生,誘導免疫記憶反應,以及交叉保護反應,外源的目的基因可以在體內不斷表達蛋白,刺激免疫系統(tǒng),所以DNA疫苗可誘發(fā)機體產生相對持久的免疫反應。旋毛蟲對宿主小腸上皮細胞的附著、侵入是其致病的關鍵,但其侵入機制目前尚不清楚。目前推測旋毛蟲對小腸上皮細胞的侵入可能是通過幼蟲的某些分泌性蛋白(即侵入相關因子)所介導的。本課題組前期通過旋毛蟲腸道感染性幼蟲與肌幼蟲的抑制消減雜交c DNA文庫,篩選出了一種分子量為46 k Da且具有水解酶活性的旋毛蟲Nudix水解酶(Ts Nd),本論文采用減毒沙門氏菌介導Ts Nd基因進入小鼠體內表達,重組質粒通過真核表達載體進行攜帶,盡最大程度保證Ts Nd基因表達的蛋白與天然蛋白有相似性。以口服方式使Ts Nd重組沙門氏菌進入體內,之后侵入腸道黏膜淋巴組織,目的基因就可以在抗原遞呈細胞中表達。Ts Nd重組菌免疫過程與旋毛蟲天然感染階段相似,含整個腸道階段均同時以腸道為入侵起點。此外,本文還應用基因工程技術構建Ts Nd基因的重組真核表達質粒(即Ts Nd DNA肌肉注射疫苗),接種動物后觀察其在體內的表達及其誘導的免疫應答與免疫保護效果。材料與方法1.旋毛蟲蟲種,載體,菌株,實驗動物及細胞系旋毛蟲(T1)由本教研室昆明小鼠傳代保種。pc DNA3.1+載體質粒,大腸埃希菌(E.coli)JM109,由本實驗室凍存保存。雌性4周齡BALB/c小鼠購自河南省實驗動物中心。所用細胞系為乳倉鼠腎細胞BHK-21,來自河南省疾控中心細胞資源中心。鼠傷寒沙門氏菌"縞ya SL1344株由河南科技大學動物科技學院動物疫病與公共安全重點實驗室惠贈。2 Ts Nd的克隆及真核表達載體的構建應用生物信息學與ORF Finder在線預測工具分析Ts Nd基因的ORF,Ts Nd基因從第111位到1358位,總長1248bp,編碼415個氨基酸。設計并合成PCR引物,擴增出Ts Nd基因片段,將其插入到載體pc DNA3.1中構成重組質粒pc DNA3.1-Ts Nd,對其進行酶切以及測序鑒定正確后,將部分電轉化入減毒沙門氏菌中,另一部分轉化入大腸桿菌BL21中保存。3重組沙門氏菌的構建及其在小鼠體內的轉錄和表達在核酸水平,將Ts Nd基因電轉化后的沙門氏菌液進行PCR鑒定,擴增后得到與理論值大小相符的Ts Nd基因條帶,說明重組沙門氏菌"縞ya SL1344/pc DNA3.1-Ts Nd構建成功;其次對重組菌的體內轉錄水平進行檢測,初次免疫后7d提取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結RNA進行RT-PCR,同時在蛋白水平利用免疫熒光試驗(IFA)檢測Ts Nd在脾臟內的表達情況。4 Ts Nd重組質粒的鑒定應用改良貝氏法收集感染后35d的旋毛蟲肌幼蟲;提取旋毛蟲總RNA逆轉錄獲得c DNA。PCR反應獲得1248bp的Ts Nd基因,將Ts Nd基因克隆到p MD19-T載體,通過Bam HI和Xho I雙酶切及單酶切,用特異性引物進行PCR鑒定陽性克隆插入Ts Nd基因片段大小的正確性。然后將Ts Nd基因亞克隆到真核表達載體pc DNA3.1,構建重組質粒pc DNA3.1-Ts Nd。序列測定證實插入片段的正確性。此外,通過重組質粒轉染BHK-21細胞,應用IFA檢測Ts Nd在BHK-21細胞的表達。5 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠誘導的免疫應答對兩種途徑免疫的小鼠尾靜脈采血,ELISA檢測抗Ts Nd抗體Ig G,Ig G1及Ig G2a。收集免疫小鼠的腸道沖洗液檢測腸道分泌型Ig A,收集脾細胞檢測細胞因子IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10。經口免疫組通過IFA檢測腸道沖洗液中特異性Ig A對旋毛蟲不同發(fā)育期蟲體的識別,而質粒肌肉注射組則通過IFA檢測免疫血清Ig G對旋毛蟲不同期蟲體的識別。6 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠誘導的免疫保護將240只小鼠BALB/c隨機分為6組(每組40只):分別對DNA疫苗口服組與肌肉注射組、空菌與空質粒對照組,兩個PBS組分別口服與肌肉注射接種免疫4次,每次免疫間隔2周;末次免疫后7d,每只小鼠經口攻擊感染300條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后7d與35d天分別剖殺小鼠,收集旋毛蟲成蟲與肌幼蟲,觀察腸道期成蟲與肌幼蟲數,計算其減蟲率。結果1.通過Bam HI和Xho I酶切,PCR鑒定及測序結果證實,成功構建了重組真核表達質粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.RT-PCR結果顯示Ts Nd基因在免疫小鼠脾臟和腸系膜淋巴結進行了轉錄;IFA結果表明Ts Nd基因在免疫小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結均有表達。3.重組質粒pc DNA3.1-Ts Nd轉染BHK-21細胞后,IFA檢測發(fā)現Ts Nd基因在BHK-21細胞中表達;Western blot分析表明在BHK-21細胞中表達的Ts Nd蛋白可被旋毛蟲感染血清以及Ts Nd重組蛋白免疫血清所識別。4.血清抗體檢測結果表明,DNA疫苗口服與肌肉注射組的特異性Ig G水平均是在第2次和第3次免疫后明顯升高,并在末次免疫后1周達到峰值,而在對照組及PBS空白對照組則無明顯改變。在初次免疫后的第4周和第6周,血清中的Ig G1水平明顯高于Ig G2a水平,Ig G2a水平在第2次免疫后及攻擊感染前均有非常明顯增高,表明DNA疫苗口服或肌肉注射免疫小鼠均誘導產生了以Th2型免疫反應為主的Th1/Th2混合型免疫反應。5.DNA疫苗口服與肌肉注射組小鼠腸道總Ig A及特異性Ig A水平與免疫前相比均有明顯升高;IFA結果表明免疫小鼠的腸道分泌型Ig A與血清Ig G均可識別旋毛蟲不同期蟲體。細胞因子檢測顯示,DNA疫苗口服與肌肉注射組的IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10均明顯高于對照組(P0.05),且免疫后4種細胞因子水平持續(xù)升高,口服與肌肉注射組均在初次免疫后第8周達到峰值,表明DNA疫苗口服與肌肉注射均誘導了Th1/Th2混合型免疫反應。6.Ts Nd DNA疫苗口服免疫組的成蟲減蟲率(73.32%)和肌幼蟲減蟲率(49.5%)明顯高于空菌對照組(Fadults=54.049,Flarvae=15.066,P0.05);肌肉注射免疫組的成蟲減蟲率(40.44%)和肌幼蟲減蟲率(53.9%)亦明顯高于空質粒照組(Fadults=43.265,Flarvae=14.598,P0.05)。結果表明Ts Nd DNA疫苗口服與肌肉注射免疫小鼠均可誘導部分免疫保護作用,口服組的成蟲減蟲率高于肌肉注射組(χ2=22.54,P0.01),但2種免疫途徑的肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.406,P0.05)。結論1.成功構建了重組質粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.將pc DNA3.1-Ts Nd電轉化減毒沙門氏菌后經口免疫小鼠或將pc DNA3.1-Ts Nd肌肉注射免疫小鼠,均可誘導特異性的腸道分泌型Ig A及Th1/Th2混合型免疫反應。3.Ts Nd DNA疫苗口服與肌肉注射免疫小鼠均可產生部分免疫保護作用,但口服組的成蟲減蟲率明顯高于肌肉注射組,肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計學意義。
【關鍵詞】：旋毛蟲 Nudix水解酶 DNA疫苗 分泌型IgA 細胞因子
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-16
• 英文縮略詞16-17
• 第一部分 旋毛蟲TsNd基因的減毒沙門氏菌運載體口服DNA疫苗研究17-64
• 1 前言17-20
• 1.1 旋毛蟲及旋毛蟲病17-18
• 1.2 旋毛蟲TsNd基因介紹18
• 1.3 減毒沙門氏菌作為疫苗運載體研究18-19
• 1.4 研究的目的和意義19-20
• 2 實驗材料方法20-42
• 2.1 主要試劑20
• 2.2 常用儀器20-21
• 2.3 主要試劑的配置21-28
• 2.4 旋毛蟲蟲種和實驗動物28
• 2.5 旋毛蟲各期蟲體的收集28-29
• 2.6 減毒沙門氏菌培養(yǎng)29
• 2.7 真核TsNd重組質粒的構建與電轉化沙門氏菌29-35
• 2.8 TsNd重組蛋白的表達與純化35-36
• 2.9 TsNd重組沙門氏菌體內體外轉錄與表達檢測36-38
• 2.10 TsNd重組沙門氏菌對宿主免疫系統(tǒng)影響的研究38-41
• 2.11 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠41-42
• 2.12 統(tǒng)計學處理42
• 3 結果42-58
• 3.1 旋毛蟲TsNd基因生物信息學分析42-43
• 3.2 提取旋毛蟲肌幼蟲總RNA43-44
• 3.3 TsNd基因PCR擴增產物44-45
• 3.4 重組克隆載體pMD19-T-TsNd的構建及酶切鑒定結果45
• 3.5 重組克隆載體pMD19-T-TsNd測序鑒定序列分析45-46
• 3.6 重組表達載體pcDNA3.1-TsNd的構建及雙酶切鑒定46-48
• 3.7 重組表達載體pcDNA3.1-TsNd電轉減毒沙門氏菌鑒定48
• 3.8 重組沙門氏菌的穩(wěn)定性鑒定48-49
• 3.9 重組沙門氏菌轉染BHK-21 細胞（細胞形態(tài)學變化）49-50
• 3.10 重組沙門氏菌轉染BHK-21 細胞（Western blotting結果）50-51
• 3.11 間接ELISA法檢測免疫特異性血清的效價51-52
• 3.12 TsNd基因體內轉錄檢測52
• 3.13 TsNd基因體內表達檢測52-53
• 3.14 TsNd免疫血清IgG抗體及亞類滴度的測定53-54
• 3.15 腸道IgA檢測54
• 3.16 腸道分泌型IgA對旋毛蟲不同期蟲體的識別54-56
• 3.17 細胞因子的檢測56
• 3.18 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染BALB/c小鼠的減蟲率56-57
• 3.19 旋毛蟲成蟲形態(tài)學變化57-58
• 4 討論58-60
• 5 結論60-61
• 參考文獻61-64
• 第二部分 旋毛蟲TsNd基因肌肉注射DNA疫苗研究64-81
• 1 前言64-65
• 1.1 寄生蟲DNA疫苗的研究進展64
• 1.2 DNA疫苗肌肉注射免疫64-65
• 1.3 研究目的與意義65
• 2 實驗材料方法65-68
• 2.1 旋毛蟲蟲種和實驗動物65
• 2.2 TsNd重組質粒的構建及濃度測定65-66
• 2.3 TsNd重組質粒在體外BHK-21 細胞中的表達66
• 2.4 TsNd重組質粒對宿主免疫系統(tǒng)影響的研究66-68
• 2.5 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠68
• 2.6 統(tǒng)計學處理68
• 3 結果68-75
• 3.1 TsNd重組質粒構建及體外表達驗證68-69
• 3.2 TsNd重組質粒濃度測定結果69
• 3.3 間接ELISA法檢測免疫特異性血清的效價69-70
• 3.4 TsNd重組質粒免疫血清IgG抗體及亞類滴度的測定70-71
• 3.5 血清IgG對旋毛蟲不同期蟲體的識別71-73
• 3.6 腸道IgA檢測73
• 3.7 細胞因子的檢測73-74
• 3.8 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠的減蟲率74-75
• 4 討論75-77
• 5 結論77-78
• 參考文獻78-81
• 綜述 寄生蟲DNA疫苗的研究進展81-96
• 參考文獻92-96
• 個人簡歷、在讀期間發(fā)表的論文96-97
• 致謝97

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