發(fā)布時(shí)間：2017-06-18 20:12

  本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：旋毛蟲病是一種幾乎呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病,主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的豬肉而感染。目前對(duì)旋毛蟲病尚無有效的預(yù)防疫苗和控制方法。因此,世界各國(guó)每年投入大量人力、物力及財(cái)力用于動(dòng)物肉類中旋毛蟲的檢疫與獸用疫苗的研究,希望阻斷旋毛蟲病由動(dòng)物向人類的傳播。近年來,感染性疾病的預(yù)防性DNA疫苗和腫瘤的治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快。DNA疫苗在接種后,其免疫和病毒的自然感染過程相似,促進(jìn)黏膜免疫的發(fā)生,誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng),以及交叉保護(hù)反應(yīng),外源的目的基因可以在體內(nèi)不斷表達(dá)蛋白,刺激免疫系統(tǒng),所以DNA疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相對(duì)持久的免疫反應(yīng)。旋毛蟲對(duì)宿主小腸上皮細(xì)胞的附著、侵入是其致病的關(guān)鍵,但其侵入機(jī)制目前尚不清楚。目前推測(cè)旋毛蟲對(duì)小腸上皮細(xì)胞的侵入可能是通過幼蟲的某些分泌性蛋白(即侵入相關(guān)因子)所介導(dǎo)的。本課題組前期通過旋毛蟲腸道感染性幼蟲與肌幼蟲的抑制消減雜交c DNA文庫,篩選出了一種分子量為46 k Da且具有水解酶活性的旋毛蟲Nudix水解酶(Ts Nd),本論文采用減毒沙門氏菌介導(dǎo)Ts Nd基因進(jìn)入小鼠體內(nèi)表達(dá),重組質(zhì)粒通過真核表達(dá)載體進(jìn)行攜帶,盡最大程度保證Ts Nd基因表達(dá)的蛋白與天然蛋白有相似性。以口服方式使Ts Nd重組沙門氏菌進(jìn)入體內(nèi),之后侵入腸道黏膜淋巴組織,目的基因就可以在抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)。Ts Nd重組菌免疫過程與旋毛蟲天然感染階段相似,含整個(gè)腸道階段均同時(shí)以腸道為入侵起點(diǎn)。此外,本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建Ts Nd基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒(即Ts Nd DNA肌肉注射疫苗),接種動(dòng)物后觀察其在體內(nèi)的表達(dá)及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)效果。材料與方法1.旋毛蟲蟲種,載體,菌株,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系旋毛蟲(T1)由本教研室昆明小鼠傳代保種。pc DNA3.1+載體質(zhì)粒,大腸埃希菌(E.coli)JM109,由本實(shí)驗(yàn)室凍存保存。雌性4周齡BALB/c小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所用細(xì)胞系為乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21,來自河南省疾控中心細(xì)胞資源中心。鼠傷寒沙門氏菌"縞ya SL1344株由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。2 Ts Nd的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用生物信息學(xué)與ORF Finder在線預(yù)測(cè)工具分析Ts Nd基因的ORF,Ts Nd基因從第111位到1358位,總長(zhǎng)1248bp,編碼415個(gè)氨基酸。設(shè)計(jì)并合成PCR引物,擴(kuò)增出Ts Nd基因片段,將其插入到載體pc DNA3.1中構(gòu)成重組質(zhì)粒pc DNA3.1-Ts Nd,對(duì)其進(jìn)行酶切以及測(cè)序鑒定正確后,將部分電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌中,另一部分轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中保存。3重組沙門氏菌的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在核酸水平,將Ts Nd基因電轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌液進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增后得到與理論值大小相符的Ts Nd基因條帶,說明重組沙門氏菌"縞ya SL1344/pc DNA3.1-Ts Nd構(gòu)建成功;其次對(duì)重組菌的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),初次免疫后7d提取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)RNA進(jìn)行RT-PCR,同時(shí)在蛋白水平利用免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)Ts Nd在脾臟內(nèi)的表達(dá)情況。4 Ts Nd重組質(zhì)粒的鑒定應(yīng)用改良貝氏法收集感染后35d的旋毛蟲肌幼蟲;提取旋毛蟲總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得c DNA。PCR反應(yīng)獲得1248bp的Ts Nd基因,將Ts Nd基因克隆到p MD19-T載體,通過Bam HI和Xho I雙酶切及單酶切,用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆插入Ts Nd基因片段大小的正確性。然后將Ts Nd基因亞克隆到真核表達(dá)載體pc DNA3.1,構(gòu)建重組質(zhì)粒pc DNA3.1-Ts Nd。序列測(cè)定證實(shí)插入片段的正確性。此外,通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,應(yīng)用IFA檢測(cè)Ts Nd在BHK-21細(xì)胞的表達(dá)。5 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答對(duì)兩種途徑免疫的小鼠尾靜脈采血,ELISA檢測(cè)抗Ts Nd抗體Ig G,Ig G1及Ig G2a。收集免疫小鼠的腸道沖洗液檢測(cè)腸道分泌型Ig A,收集脾細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10。經(jīng)口免疫組通過IFA檢測(cè)腸道沖洗液中特異性Ig A對(duì)旋毛蟲不同發(fā)育期蟲體的識(shí)別,而質(zhì)粒肌肉注射組則通過IFA檢測(cè)免疫血清Ig G對(duì)旋毛蟲不同期蟲體的識(shí)別。6 Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)將240只小鼠BALB/c隨機(jī)分為6組(每組40只):分別對(duì)DNA疫苗口服組與肌肉注射組、空菌與空質(zhì)粒對(duì)照組,兩個(gè)PBS組分別口服與肌肉注射接種免疫4次,每次免疫間隔2周;末次免疫后7d,每只小鼠經(jīng)口攻擊感染300條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后7d與35d天分別剖殺小鼠,收集旋毛蟲成蟲與肌幼蟲,觀察腸道期成蟲與肌幼蟲數(shù),計(jì)算其減蟲率。結(jié)果1.通過Bam HI和Xho I酶切,PCR鑒定及測(cè)序結(jié)果證實(shí),成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.RT-PCR結(jié)果顯示Ts Nd基因在免疫小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄;IFA結(jié)果表明Ts Nd基因在免疫小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)均有表達(dá)。3.重組質(zhì)粒pc DNA3.1-Ts Nd轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后,IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ts Nd基因在BHK-21細(xì)胞中表達(dá);Western blot分析表明在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的Ts Nd蛋白可被旋毛蟲感染血清以及Ts Nd重組蛋白免疫血清所識(shí)別。4.血清抗體檢測(cè)結(jié)果表明,DNA疫苗口服與肌肉注射組的特異性Ig G水平均是在第2次和第3次免疫后明顯升高,并在末次免疫后1周達(dá)到峰值,而在對(duì)照組及PBS空白對(duì)照組則無明顯改變。在初次免疫后的第4周和第6周,血清中的Ig G1水平明顯高于Ig G2a水平,Ig G2a水平在第2次免疫后及攻擊感染前均有非常明顯增高,表明DNA疫苗口服或肌肉注射免疫小鼠均誘導(dǎo)產(chǎn)生了以Th2型免疫反應(yīng)為主的Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。5.DNA疫苗口服與肌肉注射組小鼠腸道總Ig A及特異性Ig A水平與免疫前相比均有明顯升高;IFA結(jié)果表明免疫小鼠的腸道分泌型Ig A與血清Ig G均可識(shí)別旋毛蟲不同期蟲體。細(xì)胞因子檢測(cè)顯示,DNA疫苗口服與肌肉注射組的IFN-γ,IL-2,IL-4及IL-10均明顯高于對(duì)照組(P0.05),且免疫后4種細(xì)胞因子水平持續(xù)升高,口服與肌肉注射組均在初次免疫后第8周達(dá)到峰值,表明DNA疫苗口服與肌肉注射均誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。6.Ts Nd DNA疫苗口服免疫組的成蟲減蟲率(73.32%)和肌幼蟲減蟲率(49.5%)明顯高于空菌對(duì)照組(Fadults=54.049,Flarvae=15.066,P0.05);肌肉注射免疫組的成蟲減蟲率(40.44%)和肌幼蟲減蟲率(53.9%)亦明顯高于空質(zhì)粒照組(Fadults=43.265,Flarvae=14.598,P0.05)。結(jié)果表明Ts Nd DNA疫苗口服與肌肉注射免疫小鼠均可誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)作用,口服組的成蟲減蟲率高于肌肉注射組(χ2=22.54,P0.01),但2種免疫途徑的肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.406,P0.05)。結(jié)論1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pc DNA3.1-Ts Nd。2.將pc DNA3.1-Ts Nd電轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌后經(jīng)口免疫小鼠或?qū)c DNA3.1-Ts Nd肌肉注射免疫小鼠,均可誘導(dǎo)特異性的腸道分泌型Ig A及Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。3.Ts Nd DNA疫苗口服與肌肉注射免疫小鼠均可產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用,但口服組的成蟲減蟲率明顯高于肌肉注射組,肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲 Nudix水解酶 DNA疫苗 分泌型IgA 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-16
• 英文縮略詞16-17
• 第一部分 旋毛蟲TsNd基因的減毒沙門氏菌運(yùn)載體口服DNA疫苗研究17-64
• 1 前言17-20
• 1.1 旋毛蟲及旋毛蟲病17-18
• 1.2 旋毛蟲TsNd基因介紹18
• 1.3 減毒沙門氏菌作為疫苗運(yùn)載體研究18-19
• 1.4 研究的目的和意義19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)材料方法20-42
• 2.1 主要試劑20
• 2.2 常用儀器20-21
• 2.3 主要試劑的配置21-28
• 2.4 旋毛蟲蟲種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.5 旋毛蟲各期蟲體的收集28-29
• 2.6 減毒沙門氏菌培養(yǎng)29
• 2.7 真核TsNd重組質(zhì)粒的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)化沙門氏菌29-35
• 2.8 TsNd重組蛋白的表達(dá)與純化35-36
• 2.9 TsNd重組沙門氏菌體內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄與表達(dá)檢測(cè)36-38
• 2.10 TsNd重組沙門氏菌對(duì)宿主免疫系統(tǒng)影響的研究38-41
• 2.11 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠41-42
• 2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理42
• 3 結(jié)果42-58
• 3.1 旋毛蟲TsNd基因生物信息學(xué)分析42-43
• 3.2 提取旋毛蟲肌幼蟲總RNA43-44
• 3.3 TsNd基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物44-45
• 3.4 重組克隆載體pMD19-T-TsNd的構(gòu)建及酶切鑒定結(jié)果45
• 3.5 重組克隆載體pMD19-T-TsNd測(cè)序鑒定序列分析45-46
• 3.6 重組表達(dá)載體pcDNA3.1-TsNd的構(gòu)建及雙酶切鑒定46-48
• 3.7 重組表達(dá)載體pcDNA3.1-TsNd電轉(zhuǎn)減毒沙門氏菌鑒定48
• 3.8 重組沙門氏菌的穩(wěn)定性鑒定48-49
• 3.9 重組沙門氏菌轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞（細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化）49-50
• 3.10 重組沙門氏菌轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞（Western blotting結(jié)果）50-51
• 3.11 間接ELISA法檢測(cè)免疫特異性血清的效價(jià)51-52
• 3.12 TsNd基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄檢測(cè)52
• 3.13 TsNd基因體內(nèi)表達(dá)檢測(cè)52-53
• 3.14 TsNd免疫血清IgG抗體及亞類滴度的測(cè)定53-54
• 3.15 腸道IgA檢測(cè)54
• 3.16 腸道分泌型IgA對(duì)旋毛蟲不同期蟲體的識(shí)別54-56
• 3.17 細(xì)胞因子的檢測(cè)56
• 3.18 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染BALB/c小鼠的減蟲率56-57
• 3.19 旋毛蟲成蟲形態(tài)學(xué)變化57-58
• 4 討論58-60
• 5 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 第二部分 旋毛蟲TsNd基因肌肉注射DNA疫苗研究64-81
• 1 前言64-65
• 1.1 寄生蟲DNA疫苗的研究進(jìn)展64
• 1.2 DNA疫苗肌肉注射免疫64-65
• 1.3 研究目的與意義65
• 2 實(shí)驗(yàn)材料方法65-68
• 2.1 旋毛蟲蟲種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物65
• 2.2 TsNd重組質(zhì)粒的構(gòu)建及濃度測(cè)定65-66
• 2.3 TsNd重組質(zhì)粒在體外BHK-21 細(xì)胞中的表達(dá)66
• 2.4 TsNd重組質(zhì)粒對(duì)宿主免疫系統(tǒng)影響的研究66-68
• 2.5 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠68
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理68
• 3 結(jié)果68-75
• 3.1 TsNd重組質(zhì)粒構(gòu)建及體外表達(dá)驗(yàn)證68-69
• 3.2 TsNd重組質(zhì)粒濃度測(cè)定結(jié)果69
• 3.3 間接ELISA法檢測(cè)免疫特異性血清的效價(jià)69-70
• 3.4 TsNd重組質(zhì)粒免疫血清IgG抗體及亞類滴度的測(cè)定70-71
• 3.5 血清IgG對(duì)旋毛蟲不同期蟲體的識(shí)別71-73
• 3.6 腸道IgA檢測(cè)73
• 3.7 細(xì)胞因子的檢測(cè)73-74
• 3.8 旋毛蟲肌幼蟲攻擊感染小鼠的減蟲率74-75
• 4 討論75-77
• 5 結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 綜述 寄生蟲DNA疫苗的研究進(jìn)展81-96
• 參考文獻(xiàn)92-96
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在讀期間發(fā)表的論文96-97
• 致謝97

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8 王璐;哺乳動(dòng)物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運(yùn)動(dòng)學(xué)建模及誤差實(shí)時(shí)校正方法[D];沈陽理工大學(xué);2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)前后腫瘤負(fù)荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對(duì)肺癌診斷價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

6 王鵬;基于碳點(diǎn)@氧化石墨烯復(fù)合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測(cè)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識(shí)別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價(jià)金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：460725