本文關(guān)鍵詞：基因缺失型天壇株痘苗病毒構(gòu)建及實驗免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)具有基因組龐大、宿主范圍廣,且只在胞漿內(nèi)復(fù)制等特點。因而,作為疫苗載體廣泛應(yīng)用于各種傳染病、心血管疾病、免疫缺陷病和腫瘤疾病的治療領(lǐng)域。雖然,傳統(tǒng)的痘苗病毒,如我國的天壇株痘苗病毒,作為疫苗在消滅天花過程中發(fā)揮了重要作用,但也常引起程度不等的副作用,如全身乏力、發(fā)熱、皮疹、腦炎和眼部牛痘感染,尤其對免疫抑制患者、慢性皮膚病患者和心臟病患者尤為嚴(yán)重。目前已開發(fā)了多種以痘苗病毒為載體的基因工程活載體疫苗。除了作為表達載體已取得令人矚目的成績外,痘苗病毒載體還具有一定的問題,如載體構(gòu)建程序復(fù)雜、外源篩選標(biāo)記插入困難和重組病毒篩選困難等問題。因此,進一步提高載體疫苗效率、載體的安全性、簡化制備程序,仍成為痘苗病毒載體的研究熱點。本研究通過同源重組技術(shù)、Cre/loxp系統(tǒng)逐步敲除天壇株痘苗病毒上的TC7L~TK2L(包括C7L、C6L、C5L、C4L、C3L、C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L和K2L)、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R等基因片段,以達到減弱病毒毒力和縮小病毒宿主范圍等目的。隨后本研究通過體內(nèi)外不同實驗分析了缺失型痘苗病毒的毒力。首先通過結(jié)晶紫染色實驗和MTT檢測實驗分析了缺失型痘苗病毒的細胞內(nèi)擴散能力和細胞毒性。其次,通過鼻腔接種和顱內(nèi)接種途徑感染小鼠后,觀察體重變化和生存率,分析了缺失型痘苗病毒的毒力水平;通過皮內(nèi)接種途徑感染家兔后,觀察痘斑大小,分析了缺失型痘苗病毒對皮膚的損傷作用。進而,通過免疫小鼠,分析了缺失型痘苗病毒的免疫原性。包括,T淋巴細胞增殖實驗、細胞因子檢測實驗、特異性抗體檢測實驗及中和抗體檢測實驗來進一步分析驗證了缺失型痘苗病毒的免疫原性。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了缺失TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失型痘苗病毒MVTTEAB,遺傳穩(wěn)定性良好。5段基因的缺失不影響缺失型痘苗病毒的形態(tài)發(fā)生和正常復(fù)制。細胞水平檢測病毒毒力結(jié)果表明,MVTTEAB在細胞中的擴散能力及細胞毒性顯著減弱。痘苗病毒在家兔皮膚和小鼠體內(nèi)的毒力檢測表明,5段基因的缺失顯著減弱了痘苗病毒在動物體內(nèi)的毒力,提高了安全性。BALB/c小鼠免疫MVTTEAB后的免疫原性實驗結(jié)果表明,基因缺失型痘苗病毒可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的體液及細胞免疫應(yīng)答,并保持了其作為疫苗的免疫原性。總之,TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失在不影響免疫原性的基礎(chǔ)上減弱了病毒毒力,且減小了宿主范圍。該病毒載體為重組載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：同源重組 天壇株痘苗病毒 毒力 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 前言8-9
• 第一篇 文獻綜述9-27
• 第一章 痘苗病毒免疫逃避9-15
• 1.1 痘苗病毒概述9
• 1.2 細胞外的免疫逃避9-11
• 1.3 細胞內(nèi)的免疫逃避11-13
• 1.4 結(jié)論13-15
• 第二章 痘苗病毒的發(fā)展15-27
• 2.1 痘苗病毒起源概述15
• 2.2 第一代痘苗病毒疫苗和全球天花根除運動15-17
• 2.3 第二代痘苗病毒疫苗17-19
• 2.4 第三代痘苗病毒疫苗：在細胞中傳代培養(yǎng)而進化19-20
• 2.5 第四代痘苗病毒疫苗：基因工程疫苗的進化20-25
• 2.6 結(jié)論25-27
• 第二篇 研究內(nèi)容27-61
• 第一章 多基因缺失型痘苗病毒的構(gòu)建及篩選27-44
• 1.1 實驗材料27-28
• 1.2 實驗方法28-33
• 1.3 實驗結(jié)果33-42
• 1.4 討論42-43
• 1.5 小結(jié)43-44
• 第二章 多基因缺失型痘苗病毒的生物學(xué)特性及毒力分析44-54
• 2.1 實驗材料44-45
• 2.2 實驗方法45-47
• 2.3 結(jié)果47-52
• 2.4 討論52-53
• 2.5 小結(jié)53-54
• 第三章 多基因缺失型痘苗病毒的免疫原性研究54-61
• 3.1 實驗材料54
• 3.2 實驗方法54-57
• 3.3 結(jié)果57-59
• 3.4 討論59-60
• 3.5 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-73
• 附錄73-74
• 作者簡介74-76
• 致謝76

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本文編號：458075