發(fā)布時間：2017-06-17 06:08

  本文關鍵詞：SIRT1的選擇性剪接變異體參與大鼠神經干細胞的分化研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:神經干細胞是分布于神經系統(tǒng)的、具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞,能生成多種神經細胞。由于其免疫原性低又具有良好的遷移性能,被廣泛用于神經損傷后再生與修復領域。神經干細胞具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力,但其分化受到多種因素影響,包括細胞外環(huán)境、營養(yǎng)素、細胞因子、信號通路和轉錄因子等。而在神經損傷以及神經退行性疾病的局部微環(huán)境中,神經干細胞往往分化為神經膠質細胞,如何控制神經干細胞在特定環(huán)境下分化為預期的終末細胞是待解決的關鍵問題。沉默信息調節(jié)因子2相關酶1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一種NAD+依賴的脫乙�；�,通過對組蛋白及多種非組蛋白進行去乙酰化修飾參與細胞衰老、細胞分化、細胞凋亡、細胞糖脂代謝等重要的生理過程。已有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在神經干細胞的分化過程中發(fā)揮一定的調控作用,但有關其調控方向的研究結果不一致。例如,研究顯示誘導神經干細胞分化后SIRT1水平顯著下降,過表達SIRT1使神經干細胞向神經元的分化減少;但也有研究指出抑制SIRT1使神經干細胞的分化能力顯著提高。因此,有關SIRT1與神經干細胞分化過程的研究現(xiàn)狀是,SIRT1具有調控神經干細胞分化的作用,但究竟是神經干細胞分化的促進因子還是抑制因子,目前尚沒有統(tǒng)一結論。選擇性剪接(Alternative Splicing,AS)是指m RNA前體(Pre-m RNA)通過選擇不同剪接位點的組合,剪切掉不同的內含子或外顯子,將同一基因中的外顯子以不同的組合方式產生不同的成熟m RNA分子。不同的m RNA選擇性剪接異構體可以進一步翻譯成功能不同或互相拮抗的蛋白質,或者在相同的細胞由于表達水平的不同導致不同的表型。不同的選擇性剪接變異體在具體的細胞功能活動中可能是相互獨立或共同發(fā)揮作用。近年研究顯示SIRT1存在選擇性剪接,如人的SIRT1已經發(fā)現(xiàn)兩種選擇性剪接變異體,分別是缺失第8外顯子的SIRT1-△Exon8和缺失第2至第9外顯子的SIRT1-△Exon2/9,這兩種不同的選擇性剪接變異體各自發(fā)揮特定的功能,明顯區(qū)別于SIRT1-FL在細胞中發(fā)揮的功能。已知SIRT1廣泛分布于大鼠神經系統(tǒng),而SIRT1的選擇性剪接變異體是否也存在于此尚不清楚;如果存在,其選擇性剪接變異體的功能是什么以及它是否參與了神經干細胞的分化呢。我們推測大鼠神經系統(tǒng)可能存在SIRT1的選擇性剪接變異體,也許正是之前忽略了SIRT1選擇性剪接的存在,才導致了SIRT1在神經干細胞分化中矛盾結論的產生,即SIRT1選擇性剪接的存在可能為之前有關SIRT1作用的矛盾觀點提供一個合理的解釋。目前有關SIRT1選擇性剪接的研究多數(shù)集中在小鼠和人源細胞。大鼠是僅次于小鼠的最常用的實驗哺乳動物,已知SIRT1廣泛分布于大鼠神經系統(tǒng),探討大鼠SIRT1是否存在選擇性剪接將為后續(xù)研究選擇性剪接變異體的生理、病理功能奠定基礎。SIRT1基因在哺乳動物高度保守,而由于種屬差異,大鼠的SIRT1基因與人類并不完全相同。通過基因比對,我們推測大鼠的SIRT1基因很有可能缺失第7外顯子,即產生SIRT1-△Exon7。因此,本研究首先觀察大鼠神經系統(tǒng)是否存在SIRT1-△Exon7,其次比較SIRT1的全長(SIRT1-FL)和SIRT1的選擇性剪接變異體(SIRT1-△Exon7)在海馬(神經干細胞的來源部位)和皮層(成熟神經細胞的富集部位)這兩個部位的表達差異,為SIRT1-△Exon7是否參與神經干細胞的分化提供初步的探索;再通過比較SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神經干細胞分化前后的表達變化和酶活性差異,進一步明確SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神經干細胞分化過程中的作用。方法:1、PCR檢測SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:取新生SD大鼠的大腦組織,分離海馬與皮層。提取總RNA,普通反轉錄PCR檢測SIRT1-FL和選擇性剪接變異體SIRT1-△Exon7的表達。然后再應用RT-PCR方法分別檢測SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在海馬與皮層這兩個部位的表達。2、神經干細胞培養(yǎng)、鑒定及誘導分化:采用無血清細胞培養(yǎng)法,新生大鼠海馬神經干細胞增殖形成懸浮的神經球后,應用免疫熒光技術對神經干細胞進行鑒定,檢測其標記性蛋白巢蛋白(Nestin)的表達。再用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基誘導神經干細胞分化,隨后分別用神經元特異性的微管相關蛋白β-Tubulin抗體和神經膠質細胞特異性的膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體行免疫熒光染色,鑒定已經分化的神經元和膠質細胞。3、RT-PCR檢測SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:應用RT-PCR方法,檢測增殖的神經球和神經球誘導分化后SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7的m RNA含量。4、SIRT1酶活性檢測:用SIRT1活性檢測試劑盒檢測神經球分化前后SIRT1去乙�；富钚缘淖兓＝Y果:1、SIRT1-△Exon7和SIRT1-FL的m RNA在大鼠海馬和皮層均有表達;2、海馬SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低62.02%(P0.05),皮層SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低83.33%(P0.05);皮層SIRT1-FL m RNA含量比海馬高5.81%(P0.05),而皮層SIRT1-△Exon7的含量比海馬低56.68%(P0.05);3、神經干細胞分化前的SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低44.12%(P0.05),分化后SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低74.62%(P0.05);神經干細胞分化后的SIRT1-FL m RNA含量較分化前增高30.21%,SIRT1-△Exon7的m RNA含量較分化前降低41.02%(P0.05);分化后總的SIRT1去乙酰化酶活性較分化前增高30.08%(P0.05)。結論:1、我們首次發(fā)現(xiàn)大鼠神經系統(tǒng)存在SIRT1-△Exon7;2、SIRT1-△Exon7在海馬和皮層的表達水平都低于SIRT1-FL,皮層的SIRT1-△Exon7水平低于海馬,而皮層的SIRT1-FL水平高于海馬,間接提示SIRT1-FL可能促進了神經干細胞的分化過程而SIRT1-△Exon7可能發(fā)揮相反的作用;3、SIRT1-△Exon7在神經干細胞分化前后的表達水平都低于SIRT1-FL,分化后的SIRT1-△Exon7水平低于分化前,分化后的SIRT1-FL水平高于分化前,這一結果與海馬和皮層的實驗結果相一致,進一步明確SIRT1-FL可能促進神經干細胞分化而SIRT1-△Exon7抑制分化。神經干細胞分化后較分化前相比,總的SIRT1去乙�；富钚陨咚�(30.08%)與SIRT1-FL的m RNA含量的升高水平(30.21%)幾乎一致,提示SIRT1-FL可能是通過增高其去乙�；富钚远龠M神經干細胞的分化;而SIRT1-△Exon7在分化后不但水平下降,且由于其缺失第七外顯子而使酶活性也大大降低,因此SIRT1-△Exon7幾乎不可能對總的SIRT1酶活性的升高做出貢獻,提示SIRT1-△Exon7可能作為獨立于SIRT1-FL之外的一個信號分子抑制神經干細胞的分化。
【關鍵詞】：神經干細胞 分化 選擇性剪接 SIRT1 SIRT1-△Exon7
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 常用縮寫詞中英文對照表13-14
• 前言14-17
• 1 材料與方法17-28
• 1.1 主要儀器和試劑17-19
• 1.2 主要培養(yǎng)基、溶液的配制方法19-20
• 1.3 實驗分組20
• 1.4 實驗方法20-27
• 1.5 統(tǒng)計學處理27-28
• 2 結果28-37
• 2.1 檢測SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7 的mRNA在大鼠海馬及皮層的表達28-31
• 2.2 比較SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7 的mRNA在神經干細胞分化前后的表達差異31-37
• 3 討論37-40
• 4 結論40-41
• 參考文獻41-44
• 綜述44-50
• 參考文獻48-50
• 致謝50-51
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果51-52
• 個人簡歷52

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