本文關(guān)鍵詞：GOLPH2敲除小鼠的構(gòu)建及該蛋白在機(jī)體免疫中功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：高爾基體磷酸化蛋白2(Golgi phosphoprotein 2,GOLPH2)是新近發(fā)現(xiàn)的一種高爾基體駐留蛋白,主要表達(dá)在上皮組織中。正常情況下GOLPH2錨定在高爾基體膜上,可能參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾等過程,但是病理情況下GOLPH2會(huì)被分泌出細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn),在病毒性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌患者體內(nèi),GOLPH2在組織和血清中的表達(dá)量會(huì)顯著上升,因此可以作為肝細(xì)胞癌早期檢測的血清標(biāo)記物,并且其特異性和靈敏性優(yōu)于傳統(tǒng)的肝細(xì)胞癌生物標(biāo)記物甲胎蛋白。此外,最近的臨床研究表明前列腺癌、肺癌、阿爾茲海默病等疾病患者體內(nèi),GOLPH2的表達(dá)量也會(huì)上升,顯示其可能與多種疾病的發(fā)生或發(fā)展有廣泛的關(guān)系。IL-12在誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的過程中起到了關(guān)鍵作用,而Th1細(xì)胞在機(jī)體抵抗胞內(nèi)病原體感染以及抗腫瘤的細(xì)胞免疫中有重要作用。由于我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GOLPH2可以抑制IL-12兩個(gè)亞基p35和p40在巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄,因此我們推測患者體內(nèi)表達(dá)量上調(diào)的GOLPH2可以通過抑制IL-12間接地促進(jìn)疾病的發(fā)生。為進(jìn)一步研究GOLPH2的功能,我們通過TALEN技術(shù)構(gòu)建出GOLPH2敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,GOLPH2敲除小鼠在體型外觀、行為方式、血細(xì)胞組成、脾細(xì)胞組成及其他常見生理指標(biāo)等方面沒有顯著區(qū)別。由于內(nèi)毒素休克模型常用來研究機(jī)體的急性免疫反應(yīng)并且能引起機(jī)體產(chǎn)生大量的IL-12,因此我們給小鼠腹腔注射LPS建立該模型并檢測血清中主要免疫細(xì)胞因子的分泌情況。我們發(fā)現(xiàn)在注射LPS之后,GOLPH2敲除小鼠血清IL-12含量比野生型小鼠更高,這與我們?cè)诩?xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為進(jìn)一步了解GOLPH2在免疫學(xué)中可能起到的作用,我們運(yùn)用RNA測序技術(shù)比較了野生型小鼠和GOLPH2敲除小鼠激活的骨髓來源樹突狀細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜。測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析顯示,GOLPH2可能參與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白等結(jié)構(gòu)成分的調(diào)控。綜上所述,本研究提供了GOLPH2基因敲除小鼠,并初步探討了GOLPH2在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中可能起到的作用,為進(jìn)一步研究其功能提供了一定的理論基礎(chǔ),也為GOLPH2在人類疾病治療過程中成為藥物研發(fā)的靶點(diǎn)提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：GOLPH2 巨噬細(xì)胞 基因敲除鼠 免疫系統(tǒng) 白介素-12 RNA測序 樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 緒論11-26
• 1.1 高爾基體的結(jié)構(gòu)與功能11-12
• 1.2 高爾基體磷酸化蛋白 2（GOLPH2）的發(fā)現(xiàn)及進(jìn)一步研究12-20
• 1.2.1 GOLPH2的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.2.2 GOLPH2的基因及蛋白結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.3 GOLPH2的分布14
• 1.2.4 GOLPH2的進(jìn)一步研究14-20
• 1.3 免疫系統(tǒng)的組成和功能20-24
• 1.3.1 固有免疫和適應(yīng)性免疫20-21
• 1.3.2 適應(yīng)性免疫的特點(diǎn)21
• 1.3.3 抗原的處理和提呈21
• 1.3.4 抗原提呈細(xì)胞21-22
• 1.3.5 T細(xì)胞22-23
• 1.3.6 B細(xì)胞23-24
• 1.4 研究意義24-26
• 第二章 GOLPH2對(duì)IL-12的抑制作用26-36
• 2.1 前言26-27
• 2.2 材料與方法27-33
• 2.2.1 材料27-30
• 2.2.1.1 主要試劑與耗材27-28
• 2.2.1.2 主要儀器28
• 2.2.1.3 小鼠28
• 2.2.1.4 GOLPH2重組蛋白28
• 2.2.1.5 p35和p40啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒28
• 2.2.1.6 DMEM完全培養(yǎng)基28-29
• 2.2.1.7 BMDM誘導(dǎo)培養(yǎng)基29
• 2.2.1.8 熒光素酶檢測細(xì)胞裂解液（5×）29
• 2.2.1.9 熒光素酶檢測底物緩沖液29
• 2.2.1.10 TXS溶液29-30
• 2.2.2 方法30-33
• 2.2.2.1 rGOLPH2 的內(nèi)毒素去除30
• 2.2.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代30
• 2.2.2.3 BMDM的誘導(dǎo)和激活30-31
• 2.2.2.4 RNA的提取及RT-PCR31
• 2.2.2.5 熒光定量PCR31
• 2.2.2.6 RAW264.7 細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染31
• 2.2.2.7 熒光素酶活性測定31-32
• 2.2.2.8 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化32
• 2.2.2.9 細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒提取32
• 2.2.2.10 質(zhì)粒內(nèi)毒素的去除32
• 2.2.2.11 數(shù)據(jù)處理32-33
• 2.3 結(jié)果與分析33-36
• 2.3.1 rGOLPH2對(duì)巨噬細(xì)胞中IL-12 p35和p40轉(zhuǎn)錄的作用33-34
• 2.3.2 rGOLPH2對(duì)p35和p40啟動(dòng)子活性的效應(yīng)34-36
• 第三章 GOLPH2基因敲除小鼠的構(gòu)建36-47
• 3.1 前言36
• 3.2 材料與方法36-39
• 3.2.1 材料36-37
• 3.2.1.1 主要試劑與耗材36-37
• 3.2.1.2 Tail Buffer37
• 3.2.1.3 引物37
• 3.2.2 方法37-39
• 3.2.2.1 GOLPH2敲除小鼠受精卵的制備37-38
• 3.2.2.2 小鼠基因組制備38
• 3.2.2.3 小鼠基因型測序鑒定38-39
• 3.2.2.4 小鼠組織RNA的提取39
• 3.2.2.5 數(shù)據(jù)處理39
• 3.3 結(jié)果與分析39-47
• 3.3.1 F_1代雜合子小鼠的獲得39-41
• 3.3.2 敲除鑒定引物的設(shè)計(jì)41-42
• 3.3.3 敲除純合子鼠的獲得42-45
• 3.3.4 小鼠體內(nèi)GOLPH2 mRNA的檢測45-47
• 第四章 GOLPH2敲除小鼠生理指標(biāo)的檢測及GOLPH2在小鼠急性炎癥反應(yīng)中作用的初步探究47-60
• 4.1 前言47-48
• 4.2 材料與方法48-50
• 4.2.1 材料48
• 4.2.1.1 主要試劑與耗材48
• 4.2.1.2 主要儀器48
• 4.2.2 方法48-50
• 4.2.2.1 脾細(xì)胞的分離及流式檢測48-49
• 4.2.2.2 血細(xì)胞組成及生理指標(biāo)的檢測49
• 4.2.2.3 血清的收集49
• 4.2.2.4 內(nèi)毒素休克模型的建立49
• 4.2.2.5 ELISA檢測血清中細(xì)胞因子的含量49
• 4.2.2.6 數(shù)據(jù)處理49-50
• 4.3 結(jié)果與分析50-60
• 4.3.1 GOLPH2敲除小鼠與野生型小鼠外觀、行為方式的比較50
• 4.3.2 血細(xì)胞組成及生理指標(biāo)的檢測50-53
• 4.3.3 脾細(xì)胞組成的檢測53-55
• 4.3.4 組織HE染色55-56
• 4.3.5 內(nèi)毒素休克模型中血細(xì)胞組成及生理指標(biāo)的檢測56-58
• 4.3.6 內(nèi)毒素休克模型中ELISA檢測血清細(xì)胞因子58-60
• 第五章 BMDC的RNA測序結(jié)果及分析60-72
• 5.1 前言60
• 5.2 材料與方法60-61
• 5.2.1 材料60-61
• 5.2.1.1 主要試劑60-61
• 5.2.1.2 BMDC誘導(dǎo)培養(yǎng)基61
• 5.2.2 方法61
• 5.2.2.1 BMDC的誘導(dǎo)和培養(yǎng)61
• 5.2.2.2 BMDC的刺激61
• 5.2.2.3 RNA測序61
• 5.3 結(jié)果與分析61-72
• 5.3.1 測序樣品及測序方法61-62
• 5.3.2 測序質(zhì)量評(píng)估62-64
• 5.3.3 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)64-66
• 5.3.4 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證66-67
• 5.3.5 差異表達(dá)基因的GO聚類分析67-70
• 5.3.6 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway顯著性富集分析70-72
• 第六章 全文總結(jié)與討論72-73
• 6.1 全文總結(jié)72
• 6.2 進(jìn)一步研究的方向及展望72-73
• 附表及附圖73-75
• 參考文獻(xiàn)75-81
• 致謝81-82
• 攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文和專利82-84

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