本文關(guān)鍵詞：聯(lián)合移植干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞治療帕金森病動物模型，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]1.從行為學(xué)的角度探討聯(lián)合移植神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)和小膠質(zhì)細(xì)胞對帕金森病(PD)模型大鼠的治療作用。2.初步研究聯(lián)合移植NSCs和小膠質(zhì)細(xì)胞改善PD模型大鼠運動功能的分子機制。[方法]1.PD模型制作：取健康成年SD大鼠用立體定向注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制作PD模型。參考大鼠腦立體定位圖譜,通過立體定向儀向大鼠右側(cè)腦的前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)和尾殼核(Cpn)注射6-OHDA。術(shù)后1周(w)阿樸嗎啡(APO)誘導(dǎo)大鼠原地向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為,多次測量持續(xù)旋轉(zhuǎn)大于7/rpm視為成功模型。2. NSCs的培養(yǎng)與鑒定：取SD大鼠胚胎中腦腹側(cè)的組織,解剖顯微鏡下去除腦膜和血管、剪碎、吹打,制成單細(xì)胞懸液加入NSCs無血清培養(yǎng)液培養(yǎng),待NSCs增殖形成直徑約200μm的神經(jīng)球后傳代,傳代的NSCs可用于移植。傳代的神經(jīng)球在NSCs分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7d后進(jìn)行GFAP與TH的細(xì)胞熒光免疫染色鑒定。3.小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、分離、純化與鑒定：取新生24小時(h)內(nèi)SD大鼠,在解剖顯微鏡下取出大腦半球皮質(zhì),去除腦膜、血管和脈絡(luò)膜,經(jīng)胰酶處理后制成單細(xì)胞懸液,在含血清的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)14至21d,采用拍打法和胰酶消化法分離小膠質(zhì)細(xì)胞,差速貼壁法進(jìn)行純化,純化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行CD11b細(xì)胞免疫熒光染色鑒定,觀察小膠質(zhì)細(xì)胞純度。4.細(xì)胞聯(lián)合移植：將成功的PD模型大鼠隨機分為實驗組和對照組,實驗組將傳代的干細(xì)胞和純化的小膠質(zhì)細(xì)胞按7：3比例于損傷原位移植,每個移植孔5μ1(NSCs:3.5×105;小膠質(zhì)細(xì)胞：1.5×105)；對照組移植DMEMF/12,每孔5μl。5.行為學(xué)測試：步態(tài)調(diào)整試驗使大鼠軀體懸空,固定后肢和一側(cè)前肢,對側(cè)前肢支撐于桌面上,向前移動大鼠軀干重心,記錄10s內(nèi)著力側(cè)前肢做出調(diào)整步伐的次數(shù),在移植后1w、2w、3w比較實驗組與對照組的測試結(jié)果差異；胡須觸碰試驗使大鼠軀體懸空,固定后肢和對側(cè)前肢,使大鼠胡須觸碰桌沿,同側(cè)前肢支伸出搭上桌沿為1次陽性反應(yīng),在移植后1w、2w、3w比較實驗組與對照組的陽性表現(xiàn)結(jié)果的差異；APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗比較實驗組和對照組PD大鼠各自于移植后1w、2w、3w經(jīng)APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)速度較術(shù)前的改善情況。6.分子生物學(xué)檢測：實驗組和對照組在移植3w后取材,進(jìn)行酪氨酸羥化酶(TH)的RT-PCR檢測和腦組織TH熒光免疫組化染色。[結(jié)果]1.接受6-OHDA立體定向注射的SD大鼠共計30只,有21只經(jīng)APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)評估證實成功建立模型,模型成功率70%,隨機選取20只分為實驗組和對照組,每組10只PD模型大鼠,6只用于行為學(xué)檢測,4只用于分子生物學(xué)檢測。2.大鼠胚胎NSCs在體外培養(yǎng)7-11d形成直徑200μmo的神經(jīng)球,細(xì)胞免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)在含血清的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后,神經(jīng)球與其貼壁長出的凸起中出現(xiàn)GFAP與TH染色陽性的細(xì)胞。3.混合培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞通過拍打法和溫和胰酶胰酶消化法分離,差速貼壁的方法純化后進(jìn)行CD11b熒光免疫染色,可見95%以上的細(xì)胞為陽性。4. NSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)比單獨培養(yǎng)NSCs,TH染色陽性細(xì)胞更多。5.與對照組相比,細(xì)胞聯(lián)合移植能增加PD大鼠為適應(yīng)重心改變而調(diào)整前肢的頻率(P0.05);改善PD大鼠懸空狀態(tài)下,胡須與前肢配合觸碰桌沿的行為(P0.05)；以及改善APO誘導(dǎo)PD大鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為(P0.05)。6. RT-PCR結(jié)果顯示聯(lián)合移植1w、2w、3w后,實驗組PD大鼠腦組織DA神經(jīng)元標(biāo)志基因TH表達(dá)比對照組多, 移植3w后熒光免疫組化顯示,6-OHDA注射區(qū)域腦組織TH染色陽性細(xì)胞較對照組增多。[結(jié)論]1.胚胎NSCs能夠在體外培養(yǎng),傳代后的NSCs可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合體外培養(yǎng)能促進(jìn)NSCs向DA神經(jīng)元分化。2.在6-OHDA模型大鼠腦內(nèi)原位聯(lián)合移植NSCs和小膠質(zhì)細(xì)胞能夠改善PD大鼠的運動功能。3.移植后的PD模型大鼠腦內(nèi)TH表達(dá)增多,TH陽性細(xì)胞增多,說明聯(lián)合移植的細(xì)胞能夠在6-OHDA模型PD大鼠腦內(nèi)存活并分化為DA神經(jīng)元,DA神經(jīng)元與PD大鼠的運動功能改善關(guān)系密切。
【關(guān)鍵詞】：帕金森 干細(xì)胞 酪氨酸羥化酶
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5;R-332
【目錄】：

• 縮略詞表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-33
• 結(jié)果33-43
• 討論43-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-58
• S每嘉南，
  
  本文編號：438010
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