本文關(guān)鍵詞：TIPE對巨噬細(xì)胞的功能影響及其機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白8(Tumor necrosis factor alpha induced protein8,TNFAIP8或者TIPE)家族主要包括四個成員:TIPE,TIPE1,TIPE2和TIPE3。他們的基因序列有著高度同源性,主要參與細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生。對于維持機(jī)體免疫平衡起著重要的作用。目前的研究表明,TIPE是一種分子量為21kDa的胞漿蛋白質(zhì),其在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤增生、腫瘤侵襲及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中具有重要作用。TIPE除了在一些腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)以外,還高表達(dá)在免疫組織和細(xì)胞中�，F(xiàn)有報(bào)道主要集中在TIPE作為一種癌基因可以促進(jìn)腫瘤的生長、遷移、侵襲及浸潤,抑制腫瘤的凋亡。而有關(guān)TIPE在免疫細(xì)胞活化與功能中的作用目前還鮮有報(bào)道。固有免疫應(yīng)答是免疫體系的第一道防護(hù)線,而巨噬細(xì)胞又是固有免疫應(yīng)答中起主要作用的效應(yīng)細(xì)胞,因此研究TIPE是否影響巨噬細(xì)胞的增殖與活化及其分子機(jī)制具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。目的通過敲低TIPE在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá),研究TIPE在小鼠巨噬細(xì)胞活化和功能中的作用,并初步探討TIPE影響巨噬細(xì)胞活化的分子機(jī)制。方法通過敲低RAW264.7細(xì)胞中TIPE蛋白表達(dá),培養(yǎng)獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變,平板黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞粘附能力,平板克隆技術(shù)和MTT技術(shù)檢測TIPE對巨噬細(xì)胞增殖能力的影響,流式細(xì)胞術(shù)分析TIPE對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TIPE對巨噬細(xì)胞遷移能力的影響,ELISA試劑盒檢測TIPE對巨噬細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNFα的影響,Western Blot檢測MAPK信號通路中相關(guān)信號分子的磷酸化水平。結(jié)果體外敲低TIPE在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)之后,顯微鏡下觀察敲低TIPE可以抑制巨噬細(xì)胞的偽足形成及其黏附能力;敲低TIPE在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)之后,平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的獨(dú)立存活能力及克隆形成能力均明顯降低;MTT技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低TIPE的巨噬細(xì)胞增殖能力明顯下降;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低TIPE的巨噬細(xì)胞劃痕愈合能力下降,遷移速率降低;將巨噬細(xì)胞與FITC標(biāo)記的Dextran熒光顆粒共培養(yǎng)2h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞攝取熒光顆粒的能力明顯降低;ELISA試劑盒檢測結(jié)果表明,巨噬細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNFα的能力明顯降低。Western Blot結(jié)果顯示,在RAW264.7細(xì)胞中敲低TIPE表達(dá)后,c-Raf、Erk1/2和p38磷酸化水平均降低。以上結(jié)果提示敲低巨噬細(xì)胞中TIPE的表達(dá),顯著抑制巨噬細(xì)胞的增殖與功能,這種抑制作用可能和抑制MAPK信號通路中的相關(guān)分子的磷酸化水平有關(guān)。結(jié)論(1)敲低TIPE抑制巨噬細(xì)胞的增殖能力、黏附能力、遷移能力、抗原吞噬能力、分泌炎癥性細(xì)胞因子的能力。(2)敲低TIPE下調(diào)MAPK信號通路中c-Raf、Erk1/2和p38的磷酸化水平。
【關(guān)鍵詞】：TNFAIP8 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞因子 MAPK
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 縮略詞表10-12
• 1 引言12-14
• 2 試劑與設(shè)備14-22
• 2.1 主要試劑14-15
• 2.2 儀器與設(shè)備15-17
• 2.3 主要溶劑的配制17-22
• 3 方法22-34
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染22-24
• 3.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 3.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇22
• 3.1.3 細(xì)胞凍存22
• 3.1.4 細(xì)胞消化22-23
• 3.1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)23
• 3.1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染23-24
• 3.2 敲低TIPE穩(wěn)定株的篩選24-25
• 3.2.1 制作慢病毒顆粒24
• 3.2.2 收集慢病毒顆粒24-25
• 3.2.3 決定最優(yōu)嘌呤霉素的濃度25
• 3.2.4 慢病毒的感染與篩選25
• 3.3 敲低TIPE水平的驗(yàn)證25-29
• 3.3.1 Western blot檢測細(xì)胞中TIPE的蛋白表達(dá)25-27
• 3.3.2 RT-PCR檢測細(xì)胞中TIPE基因的表達(dá)27-29
• 3.4 細(xì)胞功能方面檢測29-32
• 3.4.1 細(xì)胞黏附能力的檢測29
• 3.4.2 細(xì)胞增殖能力的檢測29-30
• 3.4.3 細(xì)胞抗原吞噬能力的檢測30
• 3.4.4 細(xì)胞遷移能力的檢測30-31
• 3.4.5 細(xì)胞分泌炎癥性因子的檢測31-32
• 3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-34
• 4 結(jié)果34-44
• 4.1 TIPE基因沉默水平的驗(yàn)證34
• 4.2 沉默TIPE的表達(dá)抑制RAW264.7 細(xì)胞的增殖能力34-36
• 4.2.1 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測RAW264.7 細(xì)胞的增殖能力34-35
• 4.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測RAW264.7 細(xì)胞的增殖能力35-36
• 4.3 沉默TIPE的表達(dá)抑制RAW264.7 細(xì)胞的黏附和遷移能力36-39
• 4.3.1 沉默TIPE的表達(dá)抑制RAW264.7 細(xì)胞的黏附能力36-37
• 4.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測RAW264.7 細(xì)胞的遷移能力37-38
• 4.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測RAW264.7細(xì)胞的遷移能力38-39
• 4.4 沉默TIPE的表達(dá)抑制RAW264.7 細(xì)胞的抗原吞噬能力39-40
• 4.5 沉默TIPE的表達(dá)抑制RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子40-41
• 4.6 沉默TIPE下調(diào)C-RAF、ERK1/2 和P38的磷酸化水平41-44
• 5 討論44-48
• 6 結(jié)論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 綜述 TNFAIP8家族蛋白研究進(jìn)展53-63
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間參加的學(xué)術(shù)會議及研究成果64-65

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本文編號：436403