本文關(guān)鍵詞：融合蛋白DnaJ-△A146Ply經(jīng)皮下免疫對小鼠肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是一種定植在人體鼻咽部的重要病原菌,可引起肺炎、急性中耳炎、腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重侵襲性疾病。WHO最新研究表明肺炎鏈球菌是引起全世界兒童死亡的主要原因,在全世界所有五歲以下兒童死亡中占16%。目前,免疫接種是預(yù)防肺炎鏈球菌感染最為有效的方法,而市售S.pn疫苗均是基于血清特異型莢膜多糖而開發(fā)的,存在對嬰幼兒保護(hù)效果低下或血清型覆蓋有限、易于血清型轉(zhuǎn)換等不足。因此不依賴于血清型,保護(hù)效果好的新型亞單位組分疫苗-蛋白疫苗應(yīng)運而生。DnaJ-△A146Ply是本研究組構(gòu)建的肺炎鏈球菌毒力因子DnaJ和減毒Ply重組融合蛋白。前期研究顯示,△A146Ply是一種潛在粘膜佐劑,蛋白疫苗DnaJ-△A146Ply在不添加其他佐劑的情況下粘膜免疫小鼠,可誘導(dǎo)Th17型細(xì)胞應(yīng)答,刺激產(chǎn)生sIgA,有效抵抗S.pn在鼻咽部、肺部定植。皮下免疫為常規(guī)免疫方式中較安全快捷的方式之一,也是目前臨床應(yīng)用最廣的一種免疫方式,因此本研究擬探索DnaJ-△A146Ply經(jīng)皮下免疫對小鼠S.pn感染的免疫保護(hù)效果及機(jī)制,為融合蛋白DnaJ-△A146Ply疫苗的臨床前研究提供實驗基礎(chǔ)。方法:原核表達(dá)DnaJ、△A146Ply、DnaJ-△A146Ply和△A146Ply-DnaJ重組蛋白,Ni+柱純化后去內(nèi)毒素。LPS檢測試劑盒及巨噬細(xì)胞實驗排除殘余l(xiāng)ps對后續(xù)實驗干擾;重組蛋白經(jīng)皮下免疫c57bl/6小鼠,末次免疫一周后分別構(gòu)建敗血癥和定植模型,觀察小鼠生存率和鼻咽部肺部細(xì)菌載量、肺部炎癥浸潤情況;使用缺陷小鼠及抗血清體內(nèi)體外實驗,探索體液免疫應(yīng)答、t細(xì)胞免疫應(yīng)答及cd4+t細(xì)胞亞型在dnaj-△a146ply免疫保護(hù)效果中作用;elisa檢測特異性抗體效價、抗體亞型、脾細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞因子;rt-pcr檢測il-6和tnf-αmrna表達(dá)水平。westernblot檢測p-akt和p-nf-κb表達(dá)水平。結(jié)果:成功制備dnaj、△a146ply、dnaj-△a146ply和△a146ply-dnaj4種重組蛋白,sds-page分析純度達(dá)85%以上。去除lps后蛋白中剩余含量小于0.1eu/μg,可滿足動物和細(xì)胞實驗。保護(hù)效果評價實驗結(jié)果顯示:dnaj-△a146ply經(jīng)皮下免疫小鼠可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高效價的特異性igg抗體,dnaj-△a146ply免疫組較pbs對照組(p=0.0405)和dnaj組生存率明顯增高、同23價多糖疫苗組相當(dāng)(p=0.7852),鼻咽部及肺部細(xì)菌載量較pbs對照組明顯降低(p㩳0.01),肺部炎癥浸潤也較pbs組明顯減弱。體液免疫應(yīng)答結(jié)果顯示:蛋白dnaj-△a146ply免疫小鼠后,同野生小鼠相比,μmt缺陷小鼠生存率降低(p=0.0468)、鼻咽部細(xì)菌載量明顯增加(p=0.0049);dnaj-△a146ply經(jīng)皮下免疫小鼠刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體亞型以igg1、igg2a和igg2b為主,較單獨dnaj免疫組其抗體產(chǎn)生的時間更早,抗體滴度更高(p0.01);dnaj-△a146ply抗血清較陰性對照組可明顯增強(qiáng)細(xì)胞對肺炎鏈球菌吞噬、殺菌作用(P=0.0160)。DnaJ-△A146Ply抗血清可有效抵抗肺炎鏈球菌鼻咽部定植及侵襲性感染。細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果顯示:DnaJ-△A146Ply經(jīng)皮下免疫小鼠后脾細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17A較PBS對照組明顯增加(P0.05),而IL-5、IL-10同對照組無明顯差異;DnaJ-△A146Ply皮下免疫WT及基因缺陷小鼠,IL-4-/-、IFN-γ-/-和IL-17A-/-小鼠鼻咽部定植較WT小鼠中明顯增加(P0.05),同PBS組無差異;IL-4-/-、IFN-γ-/-小鼠生存率較WT小鼠生存率明顯降低(P0.05),IL-17A-/-小鼠生存率與WT小鼠無差異。DnaJ-△A146Ply免疫TLR4-/-小鼠后,其鼻咽部細(xì)菌載量顯著高于WT小鼠(P=0.014),同對照組無顯著差異(P=0.2617);而其生存率與WT小鼠無明顯差異(P=0.1842)。DnaJ-△A146Ply免疫TLR4-/-小鼠后抗體效價明顯低于WT小鼠,但抗體亞型仍以IgG1、IgG2a和IgG2b為主,脾細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17A均同各自對照組無差異,而顯著低于WT小鼠免疫組(P0.05)。DnaJ-△A146Ply可刺激腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-6、TNF-αmRNA及蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)、增強(qiáng)PI3K/AKt和NF-κB磷酸化;Akt和NF-κB抑制劑可顯著減少IL-6和TNF-α表達(dá)。結(jié)論:△A146Ply具有皮下免疫佐劑效應(yīng)。DnaJ-△A146Ply皮下免疫小鼠可通過誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答共同抵抗肺炎鏈球菌感染,其定植保護(hù)效果以TLR4依賴方式進(jìn)行。DnaJ-△A146Ply通過激活PI3K/AKt和NF-κB信號通路活化巨噬細(xì)胞啟動免疫應(yīng)答。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 DnaJ-△A146Ply 免疫應(yīng)答 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-16
• 1 實驗材料16-18
• 2 實驗方法18-24
• 3 實驗結(jié)果24-41
• 4 討論41-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 文獻(xiàn)綜述52-66
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文題錄67

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  本文關(guān)鍵詞：融合蛋白DnaJ-△A146Ply經(jīng)皮下免疫對小鼠肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：434103