目的利用原核表達系統(tǒng)表達、純化結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白Rv2660c,評價其在血清學(xué)方面用于結(jié)核病診斷的價值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,構(gòu)建pET28a-Rv2660c融合表達載體,在原核系統(tǒng)內(nèi)進行重組表達,親和層析純化重組Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA實驗分析重組蛋白的免疫反應(yīng)。結(jié)果 pET28a-Rv2660c在大腸桿菌內(nèi)成功表達重組Rv2660c蛋白,SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白分子量為10.2 KD,與預(yù)期一致,Western-Blot結(jié)果表明重組蛋白Rv2660c只能與活動性結(jié)核患者血清反應(yīng),出現(xiàn)一條雜交條帶;ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組Rv2660c蛋白與結(jié)核患者血清能產(chǎn)生較強的反應(yīng),結(jié)核病菌陽患者組、菌陰患者組、潛伏感染組以及健康對照組A450平均值分別為0.52、0.48、0.28和0.25。結(jié)論重組結(jié)核分枝桿菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,對活動性結(jié)核病的診斷具有一定的價值,但對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷沒有價值。

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【部分圖文】：

圖1 Rv2660c核酸PCR鑒定凝膠電泳鑒定結(jié)果

將合成的Rv2660c核酸序列通過分子克隆技術(shù)插入到pET-28a表達載體上,采用菌落PCR的方法進行鑒定,1%的瓊脂糖核酸電泳顯示擴增片段大小在230bp左右,與預(yù)期值相符(圖1)。將陽性克隆送華大基因公司測序,測序結(jié)果證實構(gòu)建成功。二、重組Rv2660c融合蛋白表達與....

圖2 重組Rv2660c蛋白表達SDS-PAGE分析

重組Rv2660c工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可獲得目的蛋白的原核表達,經(jīng)過冰浴超聲破碎后,SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn),在目的分子量10.2KD處有明顯的蛋白表達,箭頭所示,其中超聲破碎上清和沉淀各占50%左右(圖2)。表達上清以親和層析純化后,150mmol咪唑洗脫液獲得的純化蛋白純度....

圖3 重組Rv2660c蛋白親和純化SDS-PAGE分析

將菌陽結(jié)核病患者、菌陰結(jié)核病患者、潛伏感染者以及健康對照者的血清分別與重組蛋白進行印記實驗,實驗結(jié)果(見圖4)。活動性結(jié)核患者(包括菌陽患者和菌陰患者)的血清抗體能與獲得的重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng),出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶;而潛伏感染者和健康對照者的血清沒有出現(xiàn)雜交條帶。表明活動性....

圖4 重組Rv2660c蛋白與各類血清Western Blot結(jié)果

圖3重組Rv2660c蛋白親和純化SDS-PAGE分析四、重組Rv2660c蛋白ELISA試驗結(jié)果

本文編號：4028544