目的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EYFP熒光蛋白的HeLa細(xì)胞作為陰離子(鹵素)通道阻斷劑篩選的細(xì)胞模型,為高通量篩選陰離子(鹵素)通道阻斷劑提供條件。方法通過基因重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)YFP突變蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒載體。將慢病毒載體和包裝質(zhì)�；旌衔镛D(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒顆粒,感染HeLa細(xì)胞,進(jìn)一步利用抗性基因?qū)?xì)胞進(jìn)行puromycin篩選,純化細(xì)胞并擴(kuò)增至所需細(xì)胞量。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測目的基因EYFP-H148Q/I152L的表達(dá)效率。并驗(yàn)證EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性。結(jié)果基因測序驗(yàn)證了目的基因成功插入慢病毒載體。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,目的基因在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察到EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株能夠表達(dá)特有的EYFP黃色熒光,效率接近100%。碘離子(I-)(低滲)溶液刺激細(xì)胞陰離子(鹵素)通道的開放,內(nèi)流的I-能夠使黃色熒光淬滅。結(jié)論構(gòu)建的EYFP-HeLa細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)EYFP黃色熒光蛋白,對(duì)內(nèi)流入細(xì)胞的I...

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 目的片段的擴(kuò)增
    1.3 重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
    1.4 病毒包裝與滴度測定
    1.5 病毒載體感染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建
        1.5.1 病毒感染
        1.5.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建
        1.5.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的RT-PCR檢測
        1.5.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的Western blot檢測
    1.6 EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗(yàn)證
    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié)果
    2.1 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
    2.2 病毒滴度測定
    2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞株的建立及RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果
        2.3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞系中EYFP熒光效率
        2.3.2穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞系的RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果
    2.4 EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗(yàn)證
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