目的:利用CRISPR/Cas9技術,構(gòu)建全基因組微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)基因敲除DBA1/J小鼠,并進行繁殖、鑒定。方法:根據(jù)CRISPR/Cas9原理,構(gòu)建出miR-34a-/+DBA1/J鼠為F0代小鼠;將其與DBA1/J野生型小鼠進行雜交,通過PCR鑒定篩選出基因型為miR-34a-/+的F1小鼠;篩選miR-34a-/-的F2代小鼠,分析其生長特性、繁殖能力;通過流式細胞術檢測小鼠體內(nèi)免疫器官和外周血中T、B淋巴細胞比例。結(jié)果:獲得2只F0代小鼠,4只F1代小鼠,5只F2代小鼠;與DBA1/J小鼠比較,miR-34a-/-DBA1/J小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群比例沒有顯著變化(P> 0. 05),但B淋巴細胞比例明顯增加(P <0. 05);未發(fā)現(xiàn)miR-34a-/-DBA1/J小鼠的體重、繁殖能力有明顯的改變(P> 0. 05)。結(jié)論:通過CRISPR/Cas9技術成功敲除miR-34a基因并繁殖獲得目的小鼠。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 miR-34a基因敲除DBA1/J小鼠的構(gòu)建
        1.2.1 CRISPR/Cas9靶向位點的設計及Cas9 mR-NA和sgRNA的制備
        1.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射入小鼠受精卵
        1.2.3 miR-34a基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁殖
        1.2.4 miR-34a基因敲除小鼠鑒定
        1.2.5 miR-34a基因敲除小鼠基因測序鑒定
        1.2.6 流式細胞術分析miR-34a基因敲除鼠體內(nèi)T、B淋巴細胞比例
    1.3 統(tǒng)計學分析
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建的F0代小鼠鑒定結(jié)果
    2.2 F1代小鼠鑒定與繁育情況
    2.3 F2代小鼠鑒定與繁育情況
    2.4 F2代小鼠測序、miR-34a表達與繁育情況
    2.5 miR-34a基因敲除鼠T、B淋巴細胞比例
3 討論



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