目的:克隆家蠅的Clip-絲氨酸蛋白酶基因(Clip-Msp),并對(duì)Clip-Msp在白假絲酵母菌感染后的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行研究。方法:通過基因工程的方法,構(gòu)建pMD19-T/Clip-Msp克隆載體;采用生物信息學(xué)方法,分析Clip-Msp基因的開放閱讀框和氨基酸序列及Clip-Msp蛋白的功能結(jié)構(gòu)域;以GAPDH作為內(nèi)參照,于家蠅三齡幼蟲感染白假絲酵母菌后3、12、24及48 h時(shí),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Clip-Msp在不同組織(體壁、脂肪體、血淋巴、唾液腺、腸道、馬氏管和氣管)中的表達(dá)情況。結(jié)果:成功構(gòu)建pMD19-T/Clip-Msp克隆載體,生物信息學(xué)分析顯示,Clip-Msp基因開放閱讀框全長1 524 bp,共編碼507個(gè)氨基酸、無信號(hào)肽、存在跨膜區(qū),屬于非經(jīng)典分泌型蛋白;Clip-Msp蛋白的N端存在一個(gè)Clip結(jié)構(gòu)域,C端有一個(gè)Tryp_SPc催化結(jié)構(gòu)域,屬于單催化結(jié)構(gòu)域Clip-絲氨酸蛋白酶超家族;白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后,Clip-Msp基因在不同時(shí)間點(diǎn)、不同組織中表達(dá)存在差異(P<005),3 h時(shí)以血淋巴中表達(dá)量增加最高...

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圖1總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

家蠅三齡幼蟲總RNA電泳檢測(cè)可見：18S條帶較28S條帶明亮清晰，28S條帶暗淡模糊，說明提取的總RNA完整（圖1）。用Clip-Msp基因的克隆引物（SkF和SkR）對(duì)pMD19-T/Clip-Msp重組菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，其PCR產(chǎn)物在1524bp左右有一特異....

圖5Clip-Msp蛋白的跨膜區(qū)分析

圖4Clip-Msp蛋白的信號(hào)肽分析圖6Clip-Msp蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析

圖6Clip-Msp蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析

圖5Clip-Msp蛋白的跨膜區(qū)分析圖7三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后3h時(shí)不同組織中Clip-Msp相對(duì)表達(dá)

圖7三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后3h時(shí)不同組織中Clip-Msp相對(duì)表達(dá)

圖6Clip-Msp蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析圖8感染3日齡家蠅幼蟲后12h不同組織中Clip-Msp相對(duì)表達(dá)

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