干擾素(Interferon,或IFN)是一種由免疫細(xì)胞分泌的促炎癥細(xì)胞因子,人們目前發(fā)現(xiàn)的兩大類干擾素包括Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅱ型IFN(IFN-γ)也被稱為免疫干擾素。大量研究表明,IFN-γ在許多疾病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用,尤其在抗病毒、抗增殖、分化誘導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)特性方面。此外,IFN-γ被認(rèn)為是確定疾病特異性免疫反應(yīng)的重要標(biāo)志。因此,迫切需要建立一種可行的、準(zhǔn)確的方法在實(shí)際樣品中檢測IFN-γ。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取并合成了編碼人源IFN-γ成熟肽的DNA序列,基因大小為438 bp。PCR擴(kuò)增獲得該基因,通過基因工程方法構(gòu)建了人源IFN-γ的重組表達(dá)載體pET28a-ifn-γ,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化后獲得了分子量大小約20 kDa的重組蛋白。利用純化的IFN-γ作為抗原免疫小鼠,從免疫小鼠的脾臟中提取總RNA,然后通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA,以該cDNA為模版,擴(kuò)增出抗體的輕、重鏈可變區(qū)VL和VH基因。以(Gly4Ser)3基因?yàn)閘inker,經(jīng)SOE-PCR組裝出scFv序列,并將其構(gòu)建到噬菌體載體pCANTAB-5E上,轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌大腸桿...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２ＴＦＮ－Ｙ蛋白的三級結(jié)構(gòu)示意圖??－－

應(yīng)答中ＮＫ細(xì)胞可能起著激活和抑制的雙重作用［２５］。ＩＦＮ－ｙ有效地刺激ＮＫ細(xì)胞??活化后，可進(jìn)一步激活機(jī)體的抗原呈遞功能，在宿主細(xì)胞對抗病原體的過程中起??重要作用［２６】，如圖１－３所示。當(dāng)有外界抗原刺激時，ＩＦＮ－ｙ與ＮＫ細(xì)胞的循環(huán)擴(kuò)??增可以快速準(zhǔn)確地提氺周圍組織細(xì)胞以及....

圖１－３病毒引起的干擾素的拮抗作用示意圖［３Ｇ］??Ｆｉｇ．?１－３?Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ?ｏｆ?１ＦＮ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｂｙ?ｆｌａｖｉｖｉｍｓｅｓ??

??Ｗ??圖１－２ＴＦＮ－Ｙ蛋白的三級結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｅｒｔｉａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＩＦＮ－ｙ??（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｉｎｔｃｒａｃｔｉｖｅ／ｊｄ２Ｎ４８／ｔｅｍｐｌａｔｅｓ／）??２．３干擾素Ｙ的生物活性?....

圖I一基因工程杭體夯奧f}Gl

圖ｌ－５基因工程抗體分子結(jié)構(gòu)［４７］??Ｆｉｇ．?Ｉ－５?Ｔｈｅ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ?ａｎｔｉｂｏｄｙ．??．２單鏈抗體的嗤菌體展示系統(tǒng)??自二十世紀(jì)末，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等人成功地將具有完整抗原結(jié)合能力的ｓｃＦｖ抗體??白展示在....

圖２－２?ｚ＞－ｙ的ＰＣＲ擴(kuò)增??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｆｎ－ｙ．??

４結(jié)果??４．１人源ＩＦＮ－ｙ全長基因的ＰＣＲ擴(kuò)增與質(zhì)粒提取??從數(shù)據(jù)庫中獲得人源訴－ｙ全基因序列后（序列如圖２－１），本研究通過生物??公司合成出雙鏈ＤＮＡ，由于公司合成的ＤＮＡ量較少，且不帶酶切位點(diǎn)，合成基??因回來后，還需要進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增大量ＤＮＡ，并進(jìn)行回收。同時，按照質(zhì)....

本文編號：3894393