[目的]驗證miR-17-5p對TLRs負向調(diào)控因子SIRPα的靶向性,探討其對抗結(jié)核分枝桿菌(MTB)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。[方法]利用生物信息學(xué)預(yù)測miR-17-5p對SIRPα的靶向性,構(gòu)建SIRPα野生型和突變型報告載體,利用雙熒光素酶報告法、Western Blot、激光共聚焦等技術(shù)驗證miR-17-5p對SIRPα的靶向性;通過H37Ra感染THP-1巨噬細胞,用miR-17-5p mimics及其inhibitor處理細胞。利用Q-PCR檢測H37Ra感染后miR-17-5p的表達;通過免疫熒光、Western Blot和ELISA等技術(shù)檢測SIRPα和細胞因子TNF-α的表達情況。[結(jié)果]H37Ra感染可下調(diào)miR-17-5p表達,且隨感染復(fù)數(shù)的增加,下調(diào)表達愈加顯著;熒光素酶報告法、Western Blot等結(jié)果證實miR-17-5p可靶向結(jié)合SIRPα3’-UTR,下調(diào)SIRPα的表達,進而上調(diào)細胞因子TNF-α的表達。[結(jié)論]MTB可下調(diào)miR-17-5p表達,而miR-17-5p可靶向抑制SIRPα的表達,從而調(diào)控巨噬細胞抗MTB的炎癥反應(yīng)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 實驗材料
        1.1.2 試劑
        1.1.3 儀器
        1.1.4 培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 細胞模型的構(gòu)建
            1.2.1. 1 細胞培養(yǎng)
            1.2.1. 2 THP-1巨噬細胞的感染
            1.2.1. 3 THP-1巨噬細胞的轉(zhuǎn)染
            1.2.1. 4 MiR-17-5p表達量的檢測
        1.2.2 載體構(gòu)建及驗證
            1.2.2. 1 生物信息學(xué)預(yù)測靶基因
            1.2.2. 2 載體的構(gòu)建和鑒定
        1.2.3 靶向關(guān)系的驗證
            1.2.3. 1 MiR-17-5p表達量的檢測
            1.2.3. 2 HEK293T細胞的轉(zhuǎn)染
            1.2.3. 3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析
            1.2.3. 4 SIRPα蛋白表達水平的檢測
        1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞免疫熒光
        1.2.5 ELISA檢測炎性細胞因子TNF-α的水平
        1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 檢測H37Ra感染THP-1后miR-17-5p的表達水平
    2.2 載體構(gòu)建及測序結(jié)果驗證
    2.3 雙熒光素酶法和Western Blot驗證miR-17-5p對SIRPα的靶向性
    2.4 免疫熒光染色驗證miR-17-5p對SIRPα的靶向性
    2.5 MiR-17-5p對炎性細胞因子水平的影響
3 討論
4 結(jié)論



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