目的：探討以粉塵螨Der f 1的T細(xì)胞表位融合肽為疫苗對過敏性哮喘小鼠進(jìn)行特異性免疫治療的效果和對STAT4/STAT6信號通路的影響。方法：將Derf 1的8段T細(xì)胞表位,按照T1-T2-T3-T4-T5-T6-T7-T8連接方式合成融合肽,命名為Derf IT。將上述融合基因克隆到pET28a(+)中,構(gòu)建pET28a(+)-Der f 1 T重組載體,用限制性內(nèi)切酶驗證,將pET28a(+)-Der f 1 T重組載體轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)中,用不同濃度的IPTG小劑量誘導(dǎo)表達(dá)Der f 1 T,確定出最適濃度,然后在最適IPTG濃度條件下進(jìn)行Derf IT的大劑量表達(dá)并純化。制樣進(jìn)行SDS-PAGE、Western bloting鑒定分析表達(dá)的蛋白。以粉塵螨粗提液為致敏原,構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型,30只小鼠按每組10只隨機(jī)分為三組,PBS組、哮喘組和免疫治療組。以純化的Der f 1 T細(xì)胞表位融合肽為疫苗對哮喘小鼠模型進(jìn)行特異性免疫治療。處死小鼠,分別收集每組小鼠的標(biāo)本。應(yīng)用ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清和BALF中細(xì)胞因子IL-13和IFN-y含量及血清中...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要儀器
注釋說明清單
引言
第一部分 粉塵螨1類變應(yīng)原T細(xì)胞表位重組蛋白的構(gòu)建及鑒定
    1 研究內(nèi)容
        1.1 合成基因
        1.2 設(shè)計引物
        1.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑
        2.2 主要試劑配制
    3 實驗方法
        3.1 Derf1T細(xì)胞表位嵌合基因的制備
        3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3 重組質(zhì)粒的提取
        3.4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
        3.5 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
        3.6 菌落PCR驗證
        3.7 DNA測序測定
        3.8 Derf1,Derf1T蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)
        3.9 Derf1,Derf1T蛋白的SDS-PAGE分析
        3.10 Derf1,Derf1T蛋白的大劑量誘導(dǎo)表達(dá)
        3.11 Derf1,Derf1T蛋白的純化及鑒定
        3.12 純化產(chǎn)物的免疫印記(western blot)分析
        3.13 患者血清IgE結(jié)合活性檢測
    4 結(jié)果
        4.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        4.2 重組質(zhì)粒鑒定
        4.3 重組蛋白表達(dá)與純化
        4.4 免疫印跡實驗鑒定Western blotting
        4.5 Derf1T對患者血清IgE結(jié)合力
    討論
第二部分 Derf1的T細(xì)胞表位疫苗的治療效果和對STAT4/STAT6信號通路的影響
    1 研究內(nèi)容
    2 材料
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器設(shè)備
        2.4 主要試劑配制
    3 方法
        3.1 建立哮喘小鼠模型
        3.2 特異性免疫治療
        3.3 制備支氣管肺泡灌洗液(BALF)并進(jìn)行細(xì)胞因子檢測
        3.4 測定血清中特異性IgE(sIgE)和IgG2a水平
        3.5 培養(yǎng)脾細(xì)胞并測定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平
        3.6 制作肺組織病理切片
        3.7 提取肺組織蛋白
        3.8 Western bloting分析
        3.9 統(tǒng)計學(xué)分析
    4 結(jié)果
        4.1 肺組織病理切片檢查結(jié)果
        4.2 BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)
        4.3 BALF中細(xì)胞因子IL-13和IFN-γ含量測定
        4.4 血清中特異性IgE(sIgE)和IgG2a水平測定
        4.5 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-13和IFN-γ含量測定
        4.6 肺組織中STAT4/STAT6蛋白表達(dá)變化
    討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介及讀研期間主要科研成果
致謝



本文編號：3892115