目的:程序性死亡配體-1(PD-L1)是免疫調(diào)節(jié)途徑的重要因子,是抗腫瘤免疫療法中重要的靶標(biāo)之一。利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法:構(gòu)建Cas9和sgRNA載體,并轉(zhuǎn)錄獲得RNA,通過(guò)顯微注射方式將RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,經(jīng)過(guò)鑒定獲得F₀代陽(yáng)性小鼠。F₀代小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配獲得F₁代雜合子小鼠,再通過(guò)F₁代小鼠自交獲得F₂代純合子小鼠品系。隨后通過(guò)Real-Time PCR和流式實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)PD-L1基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況。結(jié)果:Real-Time PCR和流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示與野生型C57小鼠相比,PD-L1純合子小鼠的PD-L1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和細(xì)胞上的蛋白質(zhì)表達(dá)均有顯著性下降,僅測(cè)定到本底的信號(hào),證實(shí)已成功構(gòu)建PD-L1基因敲除小鼠品系,為PD-L1體內(nèi)基因功能研究提供了新的小鼠模型。

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 倫理聲明
    1.2 試劑、材料和動(dòng)物
        1.2.1 質(zhì)粒和動(dòng)物
        1.2.2 主要試劑
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 sgRNA設(shè)計(jì)和寡聚核苷酸鏈的合成
        1.3.2 sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建
        1.3.3 sgRNA和Cas9表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)錄
        1.3.4 陽(yáng)性小鼠品系獲得及鑒定
        1.3.5 Real-Time PCR檢測(cè)
        1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)淋巴細(xì)胞PD-L1表達(dá)
2 結(jié)果
    2.1 PD-L1基因敲除小鼠獲得
    2.2 PD-L1基因敲除小鼠mRNA水平敲除效果檢測(cè)
    2.3 PD-L1基因敲除小鼠蛋白水平敲除效果驗(yàn)證
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