本文關鍵詞：腦組織microRNA介導的EV71減毒株的構建及免疫效果評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)是微小RNA病毒科,腸道病毒屬的重要成員之一,其基因組由單股正鏈RNA構成。人類感染EV71臨床上可表現(xiàn)為:皰疹性咽峽炎,無菌性腦膜炎,腦炎,肺水腫和手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)。其中感染EV71病毒的嬰幼兒臨床上可見嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,且可導致快速惡化甚至死亡。自從1969年報告了第一例手足口病癥之后,手足口病在亞太地區(qū)形成了大流行,其中東南亞地區(qū)疫情尤其嚴重。1999年-2009年間,在中國人口密集的北京、深圳及廣州,有50多萬兒童受到由EV71引起的手足口病暴發(fā)疫情影響,最后導致了200個死亡病例。在人類成功戰(zhàn)勝脊髓灰質炎病毒之后,EV71已被認作最重要的嗜神經(jīng)性腸道病毒。目前,滅活疫苗是EV71疫苗發(fā)展的主要類型,3家國內企業(yè)自主研制的EV71滅活疫苗已經(jīng)通過臨床III期試驗,正處于審批階段。然而,滅活疫苗仍存在一些值得關注的問題。EV71誘導機體產(chǎn)生免疫保護具有復雜的機制,體液免疫和細胞免疫對于產(chǎn)生有效的保護效力而言均是十分重要的。由于滅活疫苗主要誘導的是體液免疫,不能充分誘導細胞免疫,因而不是最佳的EV71疫苗類型。減毒活疫苗是另外一種成功的疫苗類型,具有成本低,可誘導全面、長效的免疫反應等優(yōu)點,世界上已成功開發(fā)了脊髓灰質炎、乙型腦炎和麻疹等疾病的減毒活疫苗,這為EV71減毒活疫苗的研制提供了參考。然而,傳統(tǒng)的減毒活疫苗方法,主要通過體外體內傳代方法獲得,耗時較長且具有一定的不可控性。隨著基因工程技術的發(fā)展,通過反向遺傳學手段直接對病毒基因組進行操作以獲得減毒株已成為可能,先后有多種基因工程減毒活疫苗問世。micro RNA是一類非編碼的小RNA分子,廣泛的表達于真核生物中。mi RNA可通過特異性識別并結合信使RNA(m RNA),進而達到抑制轉錄后的基因表達。由于mi RNA具有在組織、種屬中均具備特異的表達譜且保持著高度保守的特性,近年來先后有學者將具有不同組織特異性的mi RNA靶序列插入不同病毒基因組內,使得病毒可在特定組織內復制而在關鍵組織中復制收到抑制的目的。這在保留病毒免疫原性的同時,又可降低病毒致病性,這一策略為研制新型減毒活疫苗提供了全新的角度。EV71感染主要導致神經(jīng)系統(tǒng)損害,研究顯示腦組織水腫,腦干及脊髓炎癥在感染EV71死亡病例中最為嚴重,因此,如果能夠抑制EV71在神經(jīng)系統(tǒng)內的復制,則有可能大大降低EV71感染導致重癥甚至死亡病例的風險。本研究中,我們首先通過反向遺傳學操作構建EV71病毒的感染性c DNA克隆,能夠高效地在細胞中拯救獲得與親本株生物學特性類似的恢復病毒;在此基礎上,為了抑制EV71病毒在神經(jīng)組織中的復制,我們選取在腦組織中豐度最高主要位于神經(jīng)元細胞的mi R-124,及在神經(jīng)元、星狀細胞、神經(jīng)膠質細胞內豐度較高的mi R-125這兩種腦組織特異性micro RNA,將其靶序列插入EV71基因組5′非編碼區(qū)不同位點,構建并拯救攜帶多個mi RNA靶序列的EV71重組病毒,鑒定了重組病毒的減毒特征;最后,我們在小鼠模型上評價了該重組病毒的免疫原性和保護效果,為下一步EV71減毒活疫苗的的研制提供參考。一、EV71病毒全長感染性克隆的構建與鑒定為了獲得可穩(wěn)定轉染表達的EV71病毒全長感染性克隆,我們首先通過PCR擴增獲得EV71病毒的全長c DNA并連接入p EV質粒,經(jīng)體外轉錄后轉染RD細胞,用RT-PCR、間接免疫熒光法和序列測定對恢復病毒進行生物學特征鑒定。上述結果表明,恢復病毒可在細胞內正確完成病毒RNA的復制及病毒蛋白的翻譯表達,并形成與野生型病毒大小一致的空斑形態(tài)。乳鼠動物模型實驗結果顯示,恢復病毒感染乳鼠可引起與野生型病毒相似的神經(jīng)癥狀和致死率。上述結果表明我們成功構建了EV71病毒全長感染性克隆,為下一步EV71病毒致病和減毒機理及新型減毒活疫苗的研究奠定基礎。二、攜帶腦組織特異micro RNA靶序列的重組EV71病毒的設計與構建為了構建EV71減毒株,基于micro RNA的減毒機制,我們將腦組織特異的mi R124和mi R125靶序列,插入到EV71病毒基因組的5′非編碼區(qū)內。通過對重組病毒的拯救與傳代培養(yǎng),我們獲得了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒。體外功能分析發(fā)現(xiàn),該病毒具有與親本株相一致的病毒感染、復制及蛋白表達能力。一步生長曲線表明,重組病毒在RD和Vero細胞上能夠有效復制,而在神經(jīng)細胞SK-N-SH上復制能力明顯減弱。隨后,我們進一步對實驗結果進行驗證,在轉染入mi RNA mimic的Vero細胞上,重組病毒的復制能力及病毒蛋白表達均明顯減弱,這說明重組病毒表現(xiàn)出的減毒特征與mi RNA調控機制有關。同時,該病毒在Vero細胞上能穩(wěn)定遺傳,連續(xù)8次傳代,其基因組內插入的mi RNA靶序列未發(fā)生任何突變或缺失。最后,我們進一步研究了該病毒在乳鼠模型上的神經(jīng)毒力及神經(jīng)侵襲力。結果顯示,EV71重組病毒以致死劑量顱內接種乳鼠,乳鼠全部存活,而親本病毒組乳鼠全部死亡。以腹腔途徑注射乳鼠,實時熒光定量PCR法未能在乳鼠顱內檢測到病毒RNA,表明重組病毒神經(jīng)侵襲力明顯減弱。綜上我們構建的重組病毒具有明顯的減毒特征,這為我們下一步評價其免疫原性奠定了基礎。三、EV71重組病毒的免疫原性及免疫保護分析最后,我們在小鼠模型上評價了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒的免疫原性。結果顯示,該重組病毒能夠誘導產(chǎn)生與親本株相似的體液免疫應答,其中和效價達到1:90。更為重要的是,該重組病毒免疫血清能100%保護乳鼠免受致死劑量的EV71病毒攻擊。上述結果表明,該重組病毒具有良好的免疫原性,能產(chǎn)生較強的免疫保護作用。綜上,本研究利用反向遺傳學技術成功構建了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒,該病毒在乳鼠動物模型上具有明顯的減毒特征且能在細胞上穩(wěn)定遺傳。同時,該病毒具有良好的免疫原性,可同時誘導小鼠產(chǎn)生較高的體液免疫,其免疫血清可保護乳鼠免受致死劑量的EV71病毒攻擊。上述研究結果,為今后研制EV71新型減毒活疫苗提供了全新的角度和理論支持。
【關鍵詞】：腸道病毒71型 microRNA 感染性克隆 減毒活疫苗 組織特異性
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 EV71 病毒全長感染性克隆的構建及鑒定15-28
• 1. 材料15-16
• 2. 方法16-21
• 3. 結果21-26
• 4. 討論26-28
• 第二部分 攜帶micro RNA靶序列重組EV71 病毒的設計與構建28-45
• 1. 材料28-29
• 2. 方法29-35
• 3. 結果35-43
• 4. 討論43-45
• 第三部分 EV71 重組病毒的免疫原性及免疫保護分析45-49
• 1. 材料45
• 2. 方法45-46
• 3. 結果46-48
• 4. 討論48-49
• 總結49-50
• 參考文獻50-52
• 碩士期間撰寫的論著52-53
• 個人簡歷53-54
• 致謝54

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1 楊e

本文編號：384503