本文關(guān)鍵詞：腦組織microRNA介導(dǎo)的EV71減毒株的構(gòu)建及免疫效果評價(jià)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)是微小RNA病毒科,腸道病毒屬的重要成員之一,其基因組由單股正鏈RNA構(gòu)成。人類感染EV71臨床上可表現(xiàn)為:皰疹性咽峽炎,無菌性腦膜炎,腦炎,肺水腫和手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)。其中感染EV71病毒的嬰幼兒臨床上可見嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,且可導(dǎo)致快速惡化甚至死亡。自從1969年報(bào)告了第一例手足口病癥之后,手足口病在亞太地區(qū)形成了大流行,其中東南亞地區(qū)疫情尤其嚴(yán)重。1999年-2009年間,在中國人口密集的北京、深圳及廣州,有50多萬兒童受到由EV71引起的手足口病暴發(fā)疫情影響,最后導(dǎo)致了200個死亡病例。在人類成功戰(zhàn)勝脊髓灰質(zhì)炎病毒之后,EV71已被認(rèn)作最重要的嗜神經(jīng)性腸道病毒。目前,滅活疫苗是EV71疫苗發(fā)展的主要類型,3家國內(nèi)企業(yè)自主研制的EV71滅活疫苗已經(jīng)通過臨床III期試驗(yàn),正處于審批階段。然而,滅活疫苗仍存在一些值得關(guān)注的問題。EV71誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)具有復(fù)雜的機(jī)制,體液免疫和細(xì)胞免疫對于產(chǎn)生有效的保護(hù)效力而言均是十分重要的。由于滅活疫苗主要誘導(dǎo)的是體液免疫,不能充分誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,因而不是最佳的EV71疫苗類型。減毒活疫苗是另外一種成功的疫苗類型,具有成本低,可誘導(dǎo)全面、長效的免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),世界上已成功開發(fā)了脊髓灰質(zhì)炎、乙型腦炎和麻疹等疾病的減毒活疫苗,這為EV71減毒活疫苗的研制提供了參考。然而,傳統(tǒng)的減毒活疫苗方法,主要通過體外體內(nèi)傳代方法獲得,耗時較長且具有一定的不可控性。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,通過反向遺傳學(xué)手段直接對病毒基因組進(jìn)行操作以獲得減毒株已成為可能,先后有多種基因工程減毒活疫苗問世。micro RNA是一類非編碼的小RNA分子,廣泛的表達(dá)于真核生物中。mi RNA可通過特異性識別并結(jié)合信使RNA(m RNA),進(jìn)而達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。由于mi RNA具有在組織、種屬中均具備特異的表達(dá)譜且保持著高度保守的特性,近年來先后有學(xué)者將具有不同組織特異性的mi RNA靶序列插入不同病毒基因組內(nèi),使得病毒可在特定組織內(nèi)復(fù)制而在關(guān)鍵組織中復(fù)制收到抑制的目的。這在保留病毒免疫原性的同時,又可降低病毒致病性,這一策略為研制新型減毒活疫苗提供了全新的角度。EV71感染主要導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害,研究顯示腦組織水腫,腦干及脊髓炎癥在感染EV71死亡病例中最為嚴(yán)重,因此,如果能夠抑制EV71在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的復(fù)制,則有可能大大降低EV71感染導(dǎo)致重癥甚至死亡病例的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中,我們首先通過反向遺傳學(xué)操作構(gòu)建EV71病毒的感染性c DNA克隆,能夠高效地在細(xì)胞中拯救獲得與親本株生物學(xué)特性類似的恢復(fù)病毒;在此基礎(chǔ)上,為了抑制EV71病毒在神經(jīng)組織中的復(fù)制,我們選取在腦組織中豐度最高主要位于神經(jīng)元細(xì)胞的mi R-124,及在神經(jīng)元、星狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)豐度較高的mi R-125這兩種腦組織特異性micro RNA,將其靶序列插入EV71基因組5′非編碼區(qū)不同位點(diǎn),構(gòu)建并拯救攜帶多個mi RNA靶序列的EV71重組病毒,鑒定了重組病毒的減毒特征;最后,我們在小鼠模型上評價(jià)了該重組病毒的免疫原性和保護(hù)效果,為下一步EV71減毒活疫苗的的研制提供參考。一、EV71病毒全長感染性克隆的構(gòu)建與鑒定為了獲得可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)的EV71病毒全長感染性克隆,我們首先通過PCR擴(kuò)增獲得EV71病毒的全長c DNA并連接入p EV質(zhì)粒,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞,用RT-PCR、間接免疫熒光法和序列測定對恢復(fù)病毒進(jìn)行生物學(xué)特征鑒定。上述結(jié)果表明,恢復(fù)病毒可在細(xì)胞內(nèi)正確完成病毒RNA的復(fù)制及病毒蛋白的翻譯表達(dá),并形成與野生型病毒大小一致的空斑形態(tài)。乳鼠動物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,恢復(fù)病毒感染乳鼠可引起與野生型病毒相似的神經(jīng)癥狀和致死率。上述結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了EV71病毒全長感染性克隆,為下一步EV71病毒致病和減毒機(jī)理及新型減毒活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。二、攜帶腦組織特異micro RNA靶序列的重組EV71病毒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建為了構(gòu)建EV71減毒株,基于micro RNA的減毒機(jī)制,我們將腦組織特異的mi R124和mi R125靶序列,插入到EV71病毒基因組的5′非編碼區(qū)內(nèi)。通過對重組病毒的拯救與傳代培養(yǎng),我們獲得了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒。體外功能分析發(fā)現(xiàn),該病毒具有與親本株相一致的病毒感染、復(fù)制及蛋白表達(dá)能力。一步生長曲線表明,重組病毒在RD和Vero細(xì)胞上能夠有效復(fù)制,而在神經(jīng)細(xì)胞SK-N-SH上復(fù)制能力明顯減弱。隨后,我們進(jìn)一步對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,在轉(zhuǎn)染入mi RNA mimic的Vero細(xì)胞上,重組病毒的復(fù)制能力及病毒蛋白表達(dá)均明顯減弱,這說明重組病毒表現(xiàn)出的減毒特征與mi RNA調(diào)控機(jī)制有關(guān)。同時,該病毒在Vero細(xì)胞上能穩(wěn)定遺傳,連續(xù)8次傳代,其基因組內(nèi)插入的mi RNA靶序列未發(fā)生任何突變或缺失。最后,我們進(jìn)一步研究了該病毒在乳鼠模型上的神經(jīng)毒力及神經(jīng)侵襲力。結(jié)果顯示,EV71重組病毒以致死劑量顱內(nèi)接種乳鼠,乳鼠全部存活,而親本病毒組乳鼠全部死亡。以腹腔途徑注射乳鼠,實(shí)時熒光定量PCR法未能在乳鼠顱內(nèi)檢測到病毒RNA,表明重組病毒神經(jīng)侵襲力明顯減弱。綜上我們構(gòu)建的重組病毒具有明顯的減毒特征,這為我們下一步評價(jià)其免疫原性奠定了基礎(chǔ)。三、EV71重組病毒的免疫原性及免疫保護(hù)分析最后,我們在小鼠模型上評價(jià)了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒的免疫原性。結(jié)果顯示,該重組病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生與親本株相似的體液免疫應(yīng)答,其中和效價(jià)達(dá)到1:90。更為重要的是,該重組病毒免疫血清能100%保護(hù)乳鼠免受致死劑量的EV71病毒攻擊。上述結(jié)果表明,該重組病毒具有良好的免疫原性,能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。綜上,本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶腦組織特異性mi RNA靶序列的EV71重組病毒,該病毒在乳鼠動物模型上具有明顯的減毒特征且能在細(xì)胞上穩(wěn)定遺傳。同時,該病毒具有良好的免疫原性,可同時誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的體液免疫,其免疫血清可保護(hù)乳鼠免受致死劑量的EV71病毒攻擊。上述研究結(jié)果,為今后研制EV71新型減毒活疫苗提供了全新的角度和理論支持。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 microRNA 感染性克隆 減毒活疫苗 組織特異性
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 EV71 病毒全長感染性克隆的構(gòu)建及鑒定15-28
• 1. 材料15-16
• 2. 方法16-21
• 3. 結(jié)果21-26
• 4. 討論26-28
• 第二部分 攜帶micro RNA靶序列重組EV71 病毒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建28-45
• 1. 材料28-29
• 2. 方法29-35
• 3. 結(jié)果35-43
• 4. 討論43-45
• 第三部分 EV71 重組病毒的免疫原性及免疫保護(hù)分析45-49
• 1. 材料45
• 2. 方法45-46
• 3. 結(jié)果46-48
• 4. 討論48-49
• 總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 碩士期間撰寫的論著52-53
• 個人簡歷53-54
• 致謝54

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本文編號：384503