PD1作為一個(gè)重要的免疫檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白,對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育和功能起著重要的作用。PD1的配體PDL1,在許多腫瘤細(xì)胞表面都有表達(dá),它們能夠抑制T細(xì)胞的葡萄糖消耗、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增殖甚至是存活率。阻斷PD1的抑制信號(hào)可以促進(jìn)T細(xì)胞的激活,增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此,PD-1抗體已成為最具前途的抗腫瘤治療藥物,代表著腫瘤免疫治療最重大的里程碑事件。鼠源抗體的人源化主要是通過(guò)分子克隆等技術(shù),將一些異源氨基酸序列替換為人源序列,在維持抗體親和力和生物活性的情況下,這種改造大大降低了免疫原性,增加了在臨床治療使用中的安全性。在我們實(shí)驗(yàn)室先前的工作中已獲得了表達(dá)PD1鼠源單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并成功純化出了PD1鼠源單克隆抗體。我們首先對(duì)這株抗體的亞型進(jìn)行了鑒定,該抗體的輕鏈和重鏈分別為Kappa鏈和Ig G鏈。其次我們提取了雜交瘤細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄,對(duì)PD1鼠源單克隆抗體的可變區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增調(diào)取,然后將該抗體的可變區(qū)通過(guò)分子克隆與人源Kappa鏈和Ig G鏈拼接,構(gòu)建到真核表達(dá)載體上。通過(guò)流式細(xì)胞分析,將這株鼠源嵌合抗體的親和力與鼠源單克隆抗體進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)親和力會(huì)隨恒定區(qū)的改變而下降。隨后,我們又對(duì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
引言
材料與方法
    1.實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要儀器與設(shè)備
        1.2 主要試劑和材料
        1.3 主要試劑配方
        1.4 主要載體、宿主菌和細(xì)胞系
    2.實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 雜交瘤細(xì)胞RNA提取
        2.2 鼠源單克隆抗體亞型鑒定
        2.3 RT-PCR
        2.4 重鏈及輕鏈可變區(qū)基因PCR
        2.5 核酸凝膠回收
        2.6 PCR或雙酶切產(chǎn)物清潔
        2.7 TA克隆
        2.8 轉(zhuǎn)化
        2.9 質(zhì)粒小量抽取
        2.10 高保真PCR擴(kuò)增
        2.11 雙酶切反應(yīng)
        2.12 酶連反應(yīng)
        2.13 真核表達(dá)
        2.14 Elisa檢測(cè)
        2.15 質(zhì)粒中量抽取
        2.16 抗體純化
        2.17 SOE-PCR
        2.18 流式細(xì)胞分析
        2.19 混合淋巴反應(yīng)
結(jié)果
    1.PD1雜交瘤細(xì)胞RNA提取
    2.PD1鼠單抗亞型鑒定
    3.PD1鼠單抗重鏈和輕鏈可變區(qū)基因提取
    4.PD1鼠嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
    5.PD1鼠嵌合抗體小量表達(dá)及活性檢測(cè)
    6.PD1鼠嵌合抗體大量表達(dá)與純化
    7.PD1人源化嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
    8.PD1人源化嵌合抗體小量表達(dá)及活性檢測(cè)
    9.PD1人源化嵌合抗體大量表達(dá)與純化
    10.PD1鼠嵌合抗體與PD1人源化嵌合抗體純化后活性鑒定
    11.PD1抗體細(xì)胞親和力流式檢測(cè)
    12.混合淋巴反應(yīng)測(cè)定PD1抗體活性
討論
參考文獻(xiàn)
綜述 Nivolumab和pembrolizumab在靶向PD1免疫治療中的比較
    參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3785790