目的:HIV-1持續(xù)性感染能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá),miR-146a作為免疫系統(tǒng)負(fù)調(diào)控分子,通過(guò)靶向多個(gè)免疫系統(tǒng)關(guān)鍵分子,負(fù)調(diào)控免疫系統(tǒng),而對(duì)于HIV-1感染來(lái)說(shuō),這種負(fù)調(diào)控則會(huì)被病毒利用,有利于病毒與宿主長(zhǎng)期共存,并逐漸累積致病效應(yīng)。這里我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-146a,以探索在敲除miR-146a后,能否在一定程度上回復(fù)細(xì)胞因子,T細(xì)胞耗竭分子表達(dá),從而增強(qiáng)免疫反應(yīng),抑制病毒復(fù)制。方法:首先我們?cè)O(shè)計(jì)了四條針對(duì)人前體miR-146a基因序列的gRNA,通過(guò)T7EN1實(shí)驗(yàn)和T載體測(cè)序?qū)嶒?yàn)來(lái)驗(yàn)證4條gRNA是否能有效編輯前體miR-146a基因。之后我們利用qPCR方法驗(yàn)證在LPS刺激下,驗(yàn)證HEK293T和A549細(xì)胞中敲除miR-146a的效果,還利用Western Blot和ELISA的方法檢測(cè)了 TRAF6、IRAK1、細(xì)胞因子的表達(dá)變化。接著我們?cè)贖IV-1感染的MT2細(xì)胞中,利用qPCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)、ELISA技術(shù)檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)miR-146a、Gag,HIV-1限制因子 MxB、IFITM1、Tetherin,細(xì)胞因子 IL...

【文章頁(yè)數(shù)】：101 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstact
1. 引言
2. 研究背景
    2.1 HIV-1與獲得性免疫缺陷病
        2.1.1 AIDS流行現(xiàn)狀
        2.1.2 HIV-1結(jié)構(gòu)和基因
        2.1.3 HIV-1的復(fù)制周期
        2.1.4 HIV-1的傳播
        2.1.5 HIV-I致病機(jī)制
        2.1.6 HIV-1病毒的限制因子
    2.2 MicroRNA-146a
        2.2.1 MicroRNA的簡(jiǎn)介
        2.2.2 MicroRNA的生成過(guò)程
        2.2.3 MicroRNA的作用機(jī)制
        2.2.4 MicroRNA受調(diào)控的機(jī)制
        2.2.5 MiR-146a的發(fā)現(xiàn)和靶基因
        2.2.6 miR-146a與天然免疫
        2.2.7 miR-146a與HIV-1
    2.3 HIV-1與細(xì)胞因子
    2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
        2.4.1 基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介
        2.4.2 CRISPR/Cas9技術(shù)的前世今生
        2.4.3 Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理
        2.4.4 CRISPR/Cas9編輯在HIV/AIDS治療中的應(yīng)用
        2.4.5 CRISPR/Cas9編輯miRNA的應(yīng)用
3. 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    3.1 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 質(zhì)粒及分子克隆試劑
        3.2.2 細(xì)胞
        3.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
        3.2.4 抗體
        3.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑
        3.2.6 蛋白印跡試劑
        3.2.7 轉(zhuǎn)染試劑
        3.2.8 ELISA及CCK8試劑盒
        3.2.9 其他試劑
        3.2.10 培養(yǎng)基的配制及儲(chǔ)存
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.3.2 質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及測(cè)序
        3.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        3.3.4 提取質(zhì)粒并鑒定
        3.3.5 轉(zhuǎn)染
        3.3.6 慢病毒的包裝
        3.3.7 HIV-1病毒擴(kuò)增及滴度測(cè)定
        3.3.8 慢病毒感染
        3.3.9 細(xì)胞基因組提取
        3.3.10 PCR擴(kuò)增目的基因靶序列片段
        3.3.11 膠回收PCR片段
        3.3.12 T7EN1實(shí)驗(yàn)
        3.3.13 T載體克隆
        3.3.14 RNA提取
        3.3.15 RNA逆轉(zhuǎn)錄
        3.3.16 Real-time PCR反應(yīng)
        3.3.17 HIV-1病毒感染MT2細(xì)胞
        3.3.18 蛋白印跡檢測(cè)蛋白
        3.3.19 ELISA
        3.3.20 流式細(xì)胞技術(shù)
        3.3.21 脫靶效應(yīng)分析
        3.3.22 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖形繪制
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 miR-146a抑制劑與miR-146a海綿抑制miR-146a表達(dá)
    4.2 CRISPR/Cas9敲除miR-146a的構(gòu)建與鑒定
    4.3 LentiCRISPR/Cas9慢病毒介導(dǎo)的高效的基因編輯
    4.4 敲除miR-146a的CRISPR/Cas9系統(tǒng)未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)
    4.5 LPS刺激敲除miR-146a細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)
    4.6 敲除miR-146a上調(diào)細(xì)胞因子和ISGs表達(dá),并回復(fù)了T細(xì)胞耗竭標(biāo)志的低表達(dá)
    4.7 敲除miR-146a后抗病毒因子的表達(dá)增加,抑制HIV-1復(fù)制和再激活
5. 討論與展望
6. 參考文獻(xiàn)
7. 已發(fā)表及待發(fā)表論文
8. 致謝



本文編號(hào)：3776797