發(fā)布時間：2023-04-01 08:19

　　目的:HIV-1持續(xù)性感染能誘導miR-146a的表達,miR-146a作為免疫系統(tǒng)負調(diào)控分子,通過靶向多個免疫系統(tǒng)關鍵分子,負調(diào)控免疫系統(tǒng),而對于HIV-1感染來說,這種負調(diào)控則會被病毒利用,有利于病毒與宿主長期共存,并逐漸累積致病效應。這里我們利用CRISPR/Cas9技術敲除miR-146a,以探索在敲除miR-146a后,能否在一定程度上回復細胞因子,T細胞耗竭分子表達,從而增強免疫反應,抑制病毒復制。方法:首先我們設計了四條針對人前體miR-146a基因序列的gRNA,通過T7EN1實驗和T載體測序實驗來驗證4條gRNA是否能有效編輯前體miR-146a基因。之后我們利用qPCR方法驗證在LPS刺激下,驗證HEK293T和A549細胞中敲除miR-146a的效果,還利用Western Blot和ELISA的方法檢測了 TRAF6、IRAK1、細胞因子的表達變化。接著我們在HIV-1感染的MT2細胞中,利用qPCR技術、Western Blot技術、ELISA技術檢測了不同時間點miR-146a、Gag,HIV-1限制因子 MxB、IFITM1、Tetherin,細胞因子 IL...

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstact
1. 引言
2. 研究背景
    2.1 HIV-1與獲得性免疫缺陷病
        2.1.1 AIDS流行現(xiàn)狀
        2.1.2 HIV-1結構和基因
        2.1.3 HIV-1的復制周期
        2.1.4 HIV-1的傳播
        2.1.5 HIV-I致病機制
        2.1.6 HIV-1病毒的限制因子
    2.2 MicroRNA-146a
        2.2.1 MicroRNA的簡介
        2.2.2 MicroRNA的生成過程
        2.2.3 MicroRNA的作用機制
        2.2.4 MicroRNA受調(diào)控的機制
        2.2.5 MiR-146a的發(fā)現(xiàn)和靶基因
        2.2.6 miR-146a與天然免疫
        2.2.7 miR-146a與HIV-1
    2.3 HIV-1與細胞因子
    2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術
        2.4.1 基因編輯技術簡介
        2.4.2 CRISPR/Cas9技術的前世今生
        2.4.3 Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理
        2.4.4 CRISPR/Cas9編輯在HIV/AIDS治療中的應用
        2.4.5 CRISPR/Cas9編輯miRNA的應用
3. 實驗材料和方法
    3.1 主要儀器設備
    3.2 實驗材料
        3.2.1 質(zhì)粒及分子克隆試劑
        3.2.2 細胞
        3.2.3 細胞培養(yǎng)試劑
        3.2.4 抗體
        3.2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應和實時定量PCR試劑
        3.2.6 蛋白印跡試劑
        3.2.7 轉染試劑
        3.2.8 ELISA及CCK8試劑盒
        3.2.9 其他試劑
        3.2.10 培養(yǎng)基的配制及儲存
    3.3 實驗方法
        3.3.1 感受態(tài)細胞的制備
        3.3.2 質(zhì)粒的構建、鑒定及測序
        3.3.3 重組質(zhì)粒轉化
        3.3.4 提取質(zhì)粒并鑒定
        3.3.5 轉染
        3.3.6 慢病毒的包裝
        3.3.7 HIV-1病毒擴增及滴度測定
        3.3.8 慢病毒感染
        3.3.9 細胞基因組提取
        3.3.10 PCR擴增目的基因靶序列片段
        3.3.11 膠回收PCR片段
        3.3.12 T7EN1實驗
        3.3.13 T載體克隆
        3.3.14 RNA提取
        3.3.15 RNA逆轉錄
        3.3.16 Real-time PCR反應
        3.3.17 HIV-1病毒感染MT2細胞
        3.3.18 蛋白印跡檢測蛋白
        3.3.19 ELISA
        3.3.20 流式細胞技術
        3.3.21 脫靶效應分析
        3.3.22 統(tǒng)計學分析及圖形繪制
4. 實驗結果
    4.1 miR-146a抑制劑與miR-146a海綿抑制miR-146a表達
    4.2 CRISPR/Cas9敲除miR-146a的構建與鑒定
    4.3 LentiCRISPR/Cas9慢病毒介導的高效的基因編輯
    4.4 敲除miR-146a的CRISPR/Cas9系統(tǒng)未檢測到脫靶效應
    4.5 LPS刺激敲除miR-146a細胞上調(diào)細胞因子表達
    4.6 敲除miR-146a上調(diào)細胞因子和ISGs表達,并回復了T細胞耗竭標志的低表達
    4.7 敲除miR-146a后抗病毒因子的表達增加,抑制HIV-1復制和再激活
5. 討論與展望
6. 參考文獻
7. 已發(fā)表及待發(fā)表論文
8. 致謝



本文編號：3776797