目的構(gòu)建并鑒定弓形蟲(chóng)RH株rop16_I/III缺陷蟲(chóng)株。方法利用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建基因缺陷蟲(chóng)株。運(yùn)用E-CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)gRNA,并使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔僷SAG1::Cas9-U6::sgUPRT質(zhì)粒上的gRNA,構(gòu)建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒。此外將rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3個(gè)片段連接成donorDNA,克隆于pUC19質(zhì)粒上,PCR擴(kuò)增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒和donor DNA片段電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲(chóng),電轉(zhuǎn)后懸液接種于HFF-1細(xì)胞中,3μmol/L乙胺嘧啶篩選電轉(zhuǎn)后的蟲(chóng)株。PCR和Western blotting鑒定克隆化篩選蟲(chóng)株。吉姆薩染色分別比較RH株和RHΔrop16株對(duì)HFF-1細(xì)胞的增殖與入侵。并比較RH株和RHΔrop16株分別感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。結(jié)果經(jīng)測(cè)序比對(duì),成功構(gòu)建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒和pUC19-donorDNA質(zhì)粒。PCR鑒定結(jié)果顯示,DHFR編碼（編碼乙胺嘧啶抗性... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞、載體和弓形蟲(chóng)株
        1.1.2 主要試劑與儀器
    1.2 方法
        1.2.1 Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        1.2.2 donor DNA質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.3 電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲(chóng)速殖子及缺陷株弓形蟲(chóng)的篩選
        1.2.4 PCR鑒定PCR鑒定引物如下:
        1.2.5 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)
        1.2.6 空斑實(shí)驗(yàn)(Plaque assays)
        1.2.7 吉姆薩染色觀察弓形蟲(chóng)的增殖
        1.2.8 毒力試驗(yàn)
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)與質(zhì)粒突變
    2.2 donorDNA質(zhì)粒的構(gòu)建與donor DNA的擴(kuò)增
    2.3 RHΔrop16蟲(chóng)株的PCR和Western blotting鑒定
    2.4 Plaque assays結(jié)晶紫染色后結(jié)果
    2.5 吉姆薩染色觀察rop16基因缺陷弓形蟲(chóng)的增殖
    2.6 毒力試驗(yàn)
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