戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E,HE）的病原體。HEV分為4個(gè)基因型,其中4型是我國(guó)流行的主要基因型。我國(guó)為HEV的流行區(qū),HE占我國(guó)急性病毒性肝炎20%左右,病死率為1.4%-5.3%,而孕婦中的病死率可達(dá)25%,這使得HE成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前限制我國(guó)HEV研究的主要原因?yàn)槿狈σ粋�(gè)高效穩(wěn)定的HEV體外培養(yǎng)系統(tǒng),雖然國(guó)外Tanaka和Shukla等分別于2007年和2011年建立了HEV的體外培養(yǎng)系統(tǒng),但我們無(wú)法獲得其毒種。本研究中,我們利用感染HEV 4型的恒河猴的糞便制備毒種,在PLC/PRF/5細(xì)胞中建立了HEV 4型的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。通過(guò)積累經(jīng)驗(yàn)和條件優(yōu)化,提高細(xì)胞培養(yǎng)的效率和穩(wěn)定性,并在此基礎(chǔ)上,對(duì)HEV在細(xì)胞培養(yǎng)中的部分特性進(jìn)行研究。取HEV 4型感染恒河猴4周后的糞便制備毒種,接種15株候選細(xì)胞株,結(jié)果顯示HEV 4型僅可在PLC/PRF/5細(xì)胞中復(fù)制并釋放至培養(yǎng)上清中。對(duì)HEV的接種時(shí)間和接種溫度進(jìn)行優(yōu)化,接種時(shí)間為2、4、6和24小時(shí)條件下,1.0x106拷貝/mlHEV接種PLC/PRF/5細(xì)胞... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
材料和試劑
    1. 材料
        1.1 恒河猴糞便
        1.2 細(xì)胞
    2. 試劑
方法
    1. 毒種的制備
    2. 細(xì)胞培養(yǎng)
    3. HEV接種(細(xì)胞株篩選階段)
    4. HEV接種PLC/PRF/5細(xì)胞
    5. 含HEV培養(yǎng)上清濃縮和粗純
    6. 病毒的pH3.0/pH11.0處理
    7. 病毒的熱滅活處理
    8. 病毒脫脂處理
    9. 含病毒上清電鏡觀察用銅網(wǎng)的制備
    10. 含病毒細(xì)胞電鏡觀察用樣品的制備
    11. 細(xì)胞免疫熒光染色
    12. pORF2抗原檢測(cè)
    13. 抗HEV全抗體檢測(cè)
    14. 抗HEV IgG抗體檢測(cè)
    15. 抗HEV IgM抗體檢測(cè)
    16. 中和試驗(yàn)
    17. Trizol溶解細(xì)胞和細(xì)胞總RNA提取
    18. 培養(yǎng)上清中病毒RNA提取
    19. Realtime RT-PCR檢測(cè)HEV RNA
    20. 基因芯片檢測(cè)：由博奧生物有限公司檢測(cè),簡(jiǎn)要描述如下
    21. 反轉(zhuǎn)錄合成細(xì)胞總cDNA
    22. 基因芯片驗(yàn)證Realtime PCR
結(jié)果
    第一部分：HEV體外細(xì)胞培養(yǎng)的建立及培養(yǎng)條件優(yōu)化
        1. HEV毒種制備及HEV RNA的Realtime RT-PCR定量檢測(cè)
        2. 候選細(xì)胞株的篩選
            2.1 候選細(xì)胞株的選擇
            2.2 接種量確定
            2.3 篩選結(jié)果
        3. 培養(yǎng)基的優(yōu)化
            3.1 背景
            3.2 MgCl_2對(duì)出毒水平的影響
            3.3 DMEM作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基,DMEM/M199作為維持培養(yǎng)基模式下,對(duì)HEV出毒水平的影響
            3.4 同時(shí)使用DMEM/M199作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基的模式下,對(duì)HEV出毒水平的影響
        4. 接種條件的優(yōu)化
            4.1 優(yōu)化前參數(shù)確定
            4.2 孵育時(shí)間的優(yōu)化
            4.3 孵育溫度的優(yōu)化
            4.4 條件優(yōu)化后不同濃度HEV接種后陽(yáng)性率結(jié)果
        5. DMEM/M199培養(yǎng)基與MEM培養(yǎng)基成份差異及差異成份對(duì)HEV出毒的影響
        6. 膽固醇促進(jìn)HEV出毒效果的確認(rèn)和特征分析
            6.1 DMEM/M199促進(jìn)HEV出毒的評(píng)價(jià)
            6.2 膽固醇對(duì)HEV出毒的促進(jìn)作用分析
        討論
        小結(jié)
    第二部分：HEV 4型培養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用研究
        1. HEV感染細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            1.1 HEV感染細(xì)胞的光鏡檢查
            1.2 免疫熒光染色
            1.3 激光共聚焦分析感染細(xì)胞
            1.4 透射電鏡觀察病毒顆粒
        2. 細(xì)胞培養(yǎng)上清中HEV病毒顆粒是否帶有包膜的免疫分析
        3. HEV 4型對(duì)理化處理的敏感性
        4. 抗HEV抗體的中和效果檢測(cè)
        5. HEV在PLC/PRF/5細(xì)胞中的傳代培養(yǎng)
        6. 基因芯片檢測(cè)HEV感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜變化
            6.1 HEV感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜變化
            6.2 芯片檢測(cè)結(jié)果的Realtime PCR驗(yàn)證
            6.3 表達(dá)水平改變基因的基本功能注釋
        7. 干擾素-α2b(IFN-α2b)對(duì)HEV復(fù)制的抑制效應(yīng)
            7.1 IFN-α2b對(duì)HEV接種細(xì)胞的細(xì)胞毒作用評(píng)價(jià)
            7.2 IFN-α2b對(duì)HEV出毒的抑制效應(yīng)評(píng)價(jià)
        討論
        小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄1: 主要儀器設(shè)備
附錄2: 縮略語(yǔ)
附錄3: 膽固醇促出毒作用分析檢測(cè)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
博士期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]急性戊型肝炎臨床分析221例[J]. 黃云麗,李卓,郝娃,謝玉蘭,陳新月.  世界華人消化雜志. 2009(18)
[2]戊型肝炎臨床特征及發(fā)病趨勢(shì)[J]. 肖非,馬科,王俊文,許東,田德英.  內(nèi)科急危重癥雜志. 2006(03)
[3]抗戊型肝炎病毒E2 IgM診斷急性戊型肝炎的敏感性和特異性[J]. 鄭玲,柳麗娟,胡瑩盈,王艷麗,溫珠妹,張宇,陳惠聰,張啟云,江家驥.  中華肝臟病雜志. 2005(08)
[4]戊型肝炎病毒在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17等傳代細(xì)胞中的繁殖[J]. 樂(lè)耕耘,吳娟,馬雁冰,杜瑞娟,莊俊英,謝天宏,李春宏,戴長(zhǎng)柏,孫茂盛.  中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào). 2001(06)



本文編號(hào)：3608365