神經(jīng)類退行性疾病如阿爾茲海默病、帕金森綜合征、亨廷頓舞蹈癥能毀滅性地影響患者的運動能力或記憶功能,給親屬及其社會造成了巨大的負擔,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合適的細胞或動物模型進行藥物治療研究。小鼠胚胎干細胞（mESCs）因其具有能分化成三個胚層細胞的多能性且不存在倫理問題而被廣泛運用在各個研究領域。然而,體外mESCs的譜系特化是不同步且難以控制的,就神經(jīng)譜系的特化而言,目前尚沒有一個嚴格的標準用于指示mESCs的神經(jīng)分化。神經(jīng)祖細胞（NPCs）是指可以分化到多種神經(jīng)元的神經(jīng)前體細胞,是mESCs分化到神經(jīng)元的中間態(tài)細胞,它既可以通過分離早期胚胎的大腦組織獲得,也可以利用ESCs進行體外分化獲得,其在臨床細胞替代性治療方面有很大的應用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的過程中,除實時觀察細胞表型變化外,沒有一個科學的系統(tǒng)行之有效地指示分化的進程,并且體外分化周期長,效率較低,導致最終獲得的NPCs細胞數(shù)量不足以達到細胞替代治療的需求,其根本原因還在于調(diào)控小鼠ESCs進行神經(jīng)分化的分子機制尚不明確。因此,亟需一種高效和嚴謹?shù)南到y(tǒng)直觀地對小鼠ESCs神經(jīng)分化進程進... 

【文章來源】：南開大學天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

神經(jīng)祖細胞發(fā)生和分化

而神經(jīng)元不具有可再生能力，要解決此類問題，以神經(jīng)祖細胞為研究平臺能更好地推動神經(jīng)細胞替代治療或者神經(jīng)類藥物篩選的研究和運用。傳統(tǒng)的體外誘導ES向神經(jīng)祖細胞方向分化主要有三種策略（圖1.2）�；跀M胚體(EB)的分化：將消化后的干細胞懸浮培養(yǎng)時能自發(fā)聚集形成EB球，其特性類似于原腸胚，球內(nèi)的細胞相互作用可導致細胞分化成為三個胚層的多種細胞。通過暴露于視黃酸或HepG2（肝癌細胞系）條件培養(yǎng)基或者特定神經(jīng)選擇性培養(yǎng)基，EB球就能夠定向向神經(jīng)譜系分化，但是其分化效率不高，僅有部分細胞能分化成神經(jīng)祖細胞[20-24]。基于神經(jīng)誘導基質(zhì)飼養(yǎng)層的分化：從胚胎骨髓或者主動脈-性腺-中腎（AGM）區(qū)分離出的基質(zhì)間充質(zhì)細胞系再在脂肪細胞分化前期，具有高效神經(jīng)誘導效能。將其與mESCs于無血清條件培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，可誘導ES向神經(jīng)方向分化。通過隨時調(diào)整條件培養(yǎng)基，用以獲得中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞亞型的定向分化。該方法由于其誘導機制尚不明確，且隨機性較強[25

第一章 引言具有Pax6-GFP報告系統(tǒng)的mESCs細胞系，將作為一種理想的工具細胞運用于大規(guī)模神經(jīng)分化相關基因和藥物的篩選研究。主要技術路線如下（圖1.3）。圖 1.3 快速高效獲得高純度NPCs的技術路線圖主要實驗步驟為：（1）構建GFP同源重組供體質(zhì)粒、Cas9表達質(zhì)粒和靶向Pax6基因的特異性sgRNA質(zhì)粒；（2）通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)的方式將質(zhì)粒導入到mESCs細胞中；（3）通過篩選標記篩選出構建成功的Pax6-GFP mESCs系并完成基因型鑒定；（4）體內(nèi)和體外對Pax6-GFP細胞系進行神經(jīng)分化的驗證；（5）通過流式分選和培養(yǎng)GFP陽性細胞并鑒定其NPCs屬性。


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