結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是結(jié)核病的病原菌。眾所周知,結(jié)核病是一種慢性呼吸道的傳染病,肺部通常最易受侵襲,大約占10%發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌是目前致死率最高的致病菌之一[1]。研究表明：每年有上百萬(wàn)的人感染結(jié)核病,已經(jīng)成為死亡率僅次于艾滋病的第二大傳染病。盡管最近幾十年已經(jīng)有很多研究致力于研發(fā)新藥物來(lái)治療結(jié)核病,但是由于多重耐藥、廣泛耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌生物膜的形成以及與HIV的共感染[2,3],給人類治療結(jié)核病帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。結(jié)核分枝桿菌在面對(duì)各種壓力環(huán)境下,主要通過(guò)進(jìn)化出一系列的修復(fù)機(jī)制、耐受機(jī)制以及自身內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制來(lái)維持其生存和繁殖。其中,結(jié)核分枝桿菌自身內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)其在各種壓力環(huán)境下的生存、致病性至關(guān)重要。目前,有研究表明：結(jié)核分枝桿菌的基因組中包含大量的潛在具有轉(zhuǎn)錄功能的基因,如GntR家族,因該家族成員和葡萄糖酸鹽調(diào)控因子具有相似性,故被稱為GntR[4]。 GntR家族許多成員已經(jīng)被證明對(duì)結(jié)核分枝桿菌在各種壓力環(huán)境下的存活發(fā)揮著重要的作用。該家族的一個(gè)顯著特點(diǎn)是N末端具有保守的DNA... 

【文章來(lái)源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１．ＲＶ０４９４蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)錄調(diào)控的假定侯選基因的功能分類圖??－

序列設(shè)計(jì)ＰＣＲ引物，以結(jié)核分枝桿菌Ｈ３７ＲＶ菌株的基因組ＤＮＡ作為模板，以水??作為陰性對(duì)照，分別用相應(yīng)的引物將基因以及其啟動(dòng)子Ｒｖ０４９４ｐ擴(kuò)增出目的??片段，目的基因大小為７２９ｂｐ，?Ｒｖ０４９４啟動(dòng)子為２００ｂｐ，?ＰＣＲ結(jié)果如圖４－１Ａ??所示，在５００－７５０?ｂｐ之間有一條帶，為目的片段。圖４－１Ｂ所示，在２００?ｂｐ左??右有一條帶，為啟動(dòng)子目的片段。??Ａ?Ｍ２３４５６?７?８９?Ｂ?Ｍ２?３４?５??２０００?—?２０００??１?概—１０００?－??—?２５０—２００ｂｐ??１００—??圖４￣ｌ．?Ｒｖ０４９４目的基因的體外擴(kuò)增??Ａ：以結(jié)核分枝桿菌Ｈ３７ＲＶ的基因組為模板擴(kuò)增Ｒｖ（Ｍ９４基因，??Ｍ表示ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００，?２－８為目的條帶，９為陰性對(duì)照??Ｂ：?ＲＶ０４９４啟動(dòng)子的體外擴(kuò)增，Ｍ表示ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００，２－４為目的條帶，５為陰性對(duì)照??Ｆｉｇ．?４－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｙ?ｔｈｅ?Ｒｖ０４９４?ａｎｄ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｏｆＭ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?Ｈ３７Ｒｖ．??Ａ．?Ｌｉｎｅ?Ｍ，?Ｍａｒｔｅｒ?ＤＬ２０００；?Ｌｉｎｅ?２－８，?Ｒｖ０４９４?ｇｅｎｅ；?Ｌｉｎｅ?９，Ｎｅｇｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??Ｂ．?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｙ?ｔｈｅ?Ｒｖ０４９４?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｏｆ?Ｍ．?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?Ｈ３７Ｒｖ．??Ｌｉｎｅ?Ｍ

接種陽(yáng)性單克隆于ＬＢ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至０￡＞６（）（）＝０．４？０．６時(shí)，加終濃度為??２４?ｔｉｇ／ｍＬ的ＩＰＴＧ誘導(dǎo)劑，３７?°Ｃ培養(yǎng)４ｈ誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，然后用１２％?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??膠檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖４－３Ａ所示。結(jié)核菌Ｈ３７ＲＶ?Ｒｖ（Ｍ９４編碼２４２??個(gè)氨基酸殘基的蛋白共２５．９９ｋＤａ，加上ｐＥＴ２８的融合標(biāo)簽則大小約為３１?ｋＤａ。圖箭??頭所示即為重組蛋白，在大小約３１?ｋＤａ處出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，但相應(yīng)對(duì)照的空載??菌沒(méi)有此條帶，說(shuō)明蛋白成功的表達(dá)，如圖４－３Ｂ所示為純化的ＲＶ０４９４蛋白。??．?Ｍ?１?２?３?４?５?６??９７．２—??６６．４—??４４．３—??２９．。－?３１?ｋＤａ??２０．１—??１４．３—??Ｂ?ｍｍｍ?ｍｍｒｎｍｍ＇?＜—３１?ｋＤａ??圍４－３．?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＢＬ２：ｌ－ｐＥＴ２８－／？ｖ０４９４誘導(dǎo)表達(dá)純化情況??Ａ：?Ｍ?表示蛋白?ｍａｒｋｅｒ，１：?ＢＬ２１－ｐＥＴ２８－／？ｖ０４９４?誘導(dǎo)前全蛋白；２：?ＢＬ２１－ｐＥＴ２８－及誘導(dǎo)??３２??


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