實驗目的:1.建立體外誘導小鼠原始生殖樣細胞（primordial germ cell-like cells,PGCLCs）分化體系。2.鑒定體外誘導小鼠原始生殖細胞分化過程中長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）表達量的變化。3.對小鼠原始生殖細胞誘導過程中關鍵長鏈非編碼RNA進行功能預測。4.獲取小鼠體內(nèi)原始生殖細胞分化過程E5.5天外胚層細胞和E12.5天原始生殖細胞。實驗方法:首先,我們模擬小鼠原始生殖細胞（primordial germ cells,PGCs）體內(nèi)分化生成過程,在體外經(jīng)過兩步誘導方法建立PGCLCs誘導體系。起始細胞我們使用小鼠胚胎干細胞（ESC）,先經(jīng)過兩天貼壁培養(yǎng)誘導成為扁平狀的外胚層樣細胞（Epiblastlike cells,Epi LCs）,然后取合適的細胞數(shù)量采用懸滴培養(yǎng)的方式繼續(xù)誘導培養(yǎng)4-5天獲得原始生殖樣細胞（Primordial germ cell-like cells,PGCLCs）。我們使用PGCs分化特異性的標記基因Blimp1-GFP指示體外誘導前期階段的成功,然后在需要收取分化樣品的第4天用CD6... 

【文章來源】：大連醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

在體內(nèi)，PGC來源于胚胎E6.5-7.5天的植入后外胚層細胞，響應來自胚外外胚層(extra-embryonicectoderm,ExE)的BMP和來自胚內(nèi)內(nèi)胚層(viscerralendoderm,VE)的BMP2信號

殖細胞與臨近的體細胞區(qū)分開來。BLIMP1 突變導致 E8.5 天的胞樣細胞異常，使他們更像臨近的體細胞[11]，通過野生型和 BL始生殖細胞的比較，發(fā)現(xiàn)了 Prdm14[12]。Prdm14 突變導致異常原。從 E8.5 天 H3K9me2 的全基因組的擦除來看，這些細胞表現(xiàn)缺失，部分原因是 Ehmt1-Ehmt2 介導的 H3K9 甲基化轉移酶活胞也表現(xiàn)出全基因組的 polycomb 酶 EZH2 介導的 H3K27me3 Prdm14 至少對早期生殖細胞的表觀遺傳程序很重要[13]。進一P1 表達是被 PRDM14 所維持[14]。PRDM14 也誘導 Dppa3 和 S表達。因此，無論是原始生殖細胞特化基因的表達還是多能基因-null 細胞中均不能發(fā)生[15]。而 Tcfap2c，編碼 AP2γ(BLIMP1 于 PGC 特化至關重要[12, 16]，因為這一基因的突變導致 PGC 在，BLIMP1、PRDM14 和 AP2γ共同組成了 PGC 特化的相互依

鼠配子發(fā)生的體外重構:mESC/iPSC在 ActA和 bFGF的作用下經(jīng)過兩天培養(yǎng)成為包括 BMP4 等細胞因子的刺激下，經(jīng)過 4-6 天的培養(yǎng)成為 PGCLC。雄性的 PGC分選移植到新生的 W/Wv品系的小鼠睪丸中，完成精子生成過程；雌性 PGCLC 經(jīng)，和胚體卵巢內(nèi)的體細胞共培養(yǎng)，形成 重構卵巢 ，然后經(jīng)過一系列的表觀遺傳進入減數(shù)分裂。長鏈非編碼 RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)乳動物中，基于全基因組水平的轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，大約有三分之二的基被轉錄成 RNA，但是這與最終只有少于 2%的基因組 DNA 翻譯成蛋白比。即使蛋白質(zhì)可以被選擇性剪接和翻譯后修飾，基因組轉錄出的非還是要多于編碼蛋白的 RNA。這就說明，非編碼 RNA 的調(diào)控在真核生中起到了非常重要的作用。非編碼 RNA（lncRNA）在數(shù)量上遠少于信使 RNA（mRNA），其長度


本文編號：3510370