腸道病毒EV71是引起手足口�。╤and,foot and mouth disease HFMD）的主要病原體,其感染人群主要為嬰幼兒,癥狀輕微者會出現(xiàn)斑丘疹和皰疹,而嚴(yán)重的患者會出現(xiàn)神經(jīng)性系統(tǒng)疾病,如病毒性腦膜炎、腦炎、腦干腦炎和急性弛緩性麻痹等,嚴(yán)重威脅到公共安全。本論文采用經(jīng)典的單克隆抗體技術(shù),制備和篩選了針對EV71非結(jié)構(gòu)蛋白靶標(biāo)2A和表面結(jié)構(gòu)蛋白靶標(biāo)VP1的系列單克隆抗體,并對這些抗體進(jìn)行了鑒定和初步的研究分析。1.利用原核表達(dá)的2A蛋白免疫小鼠,通過細(xì)胞融合篩選分泌2A特異性IgG的雜交瘤細(xì)胞株,并根據(jù)抗體類別轉(zhuǎn)換機(jī)制,采用有限稀釋法進(jìn)一步篩選獲得2A特異性IgA型雜交瘤細(xì)胞株2A5 IgA和5F11 IgA。利用小鼠腹水制備獲得大量純化的IgA和IgG單克隆抗體,通過體外Transwell系統(tǒng)極化上皮細(xì)胞測定IgA抗體通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性及其對EV71病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明,這兩株2A特異性抗體2A5 IgA和5F11 IgA均能通過上皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),并有效抑制病毒復(fù)制,且這種抑制效應(yīng)依賴于IgA抗體的濃度。2.采用同樣的雜交瘤技術(shù)路線也篩選獲得9株VP1特異性IgG雜交... 

【文章來源】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)湖北省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 EV71的流行病學(xué)介紹
    1.2 EV71的病毒學(xué)特征
    1.3 EV71疫苗研究現(xiàn)狀
    1.4 EV712A蛋白及其功能
    1.5 黏膜免疫系統(tǒng)和分泌性sIgA
    1.6 EV71VP1蛋白和抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)
    1.7 單克隆抗體技術(shù)
    1.8 利用抗體類型轉(zhuǎn)換獲得產(chǎn)IgA的雜交瘤細(xì)胞株
    1.9 通透膜系統(tǒng)(Transwell System)模擬體內(nèi)黏膜系統(tǒng)微環(huán)境
    1.10 本研究的目的和意義
第2章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)用耗材
        2.1.4 生物材料
        2.1.5 溶液和培養(yǎng)基配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 腸道病毒EV71 mRNA的提取
        2.2.2 pET-28a-2A和pET-28a-VP1克隆構(gòu)建
        2.2.3 蛋白的表達(dá)純化及檢測
        2.2.4 蛋白檢測
        2.2.5 細(xì)胞傳代培養(yǎng)凍存和復(fù)蘇
        2.2.6 細(xì)胞融合
        2.2.7 雜交瘤細(xì)胞上清檢測(ELISA)
        2.2.8 融合細(xì)胞的單克隆化
        2.2.9 有限稀釋法篩選IgA分泌型單克隆雜交瘤細(xì)胞株
        2.2.10 免疫熒光驗(yàn)證IgG/IgA分泌型單克隆雜交瘤細(xì)胞株的特異性
        2.2.11 腹水制備與抗體純化
        2.2.12 Transwell模型培養(yǎng)極化的上皮細(xì)胞
        2.2.13 Transwell極化細(xì)胞的生長和電阻的測定
        2.2.14 Transwell中的抗體效應(yīng)實(shí)驗(yàn)
        2.2.15 經(jīng)典中和實(shí)驗(yàn)檢測VP1-IgGs的體外中和活性
        2.2.16 THP-1細(xì)胞中驗(yàn)證病毒的抗體依賴性增強(qiáng)作用
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 EV712A特異性IgA單克隆抗體的制備及其對病毒復(fù)制的影響
        3.1.1 EV71BrCr株2A蛋白原核表達(dá)克隆構(gòu)建
        3.1.2 EV71 2A蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化和鑒定
        3.1.3 EV71 2A特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選和鑒定
        3.1.4 利用競爭性ELISA驗(yàn)證2A蛋白單克隆抗體識別表位
        3.1.5 利用抗體類型轉(zhuǎn)換篩選特異性的產(chǎn)IgA的雜交瘤細(xì)胞株
        3.1.6 腹水制備與抗體純化
        3.1.7 IgA抗體在Transwell系統(tǒng)中的定向轉(zhuǎn)運(yùn)
        3.1.8 EV71在Transwell系統(tǒng)中的復(fù)制曲線的測定
        3.1.9 2A-IgA在Transwell系統(tǒng)中的胞內(nèi)中和測定
        3.1.10 2AIgA胞內(nèi)中和的濃度依賴效應(yīng)
    3.2 EV71 VP1特異性IgG單克隆抗體的篩選及其對病毒復(fù)制的影響
        3.2.1 EV71 BrCr株VP1蛋白原核表達(dá)克隆構(gòu)建
        3.2.2 EV71 VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化和鑒定
        3.2.3 EV71 VP1特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選和鑒定
        3.2.4 利用競爭性ELISA驗(yàn)證VP1單克隆抗體識別表位
        3.2.5 檢測VP1-IgGs對VP1消化的小片段多肽的識別表位
        3.2.6 VP1-IgGs腹水制備與抗體純化
        3.2.7 VP1-IgGs體外中和實(shí)驗(yàn)
        3.2.8 VP1-IgGs協(xié)同中和實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 EV71在THP-1細(xì)胞中的復(fù)制曲線測定
        3.2.10 EV71 VP1-IgGs在THP-1細(xì)胞中的對病毒復(fù)制的影響
        3.2.11 WesternBlot鑒定EV71-VP1 IgGs識別VP1抗原表位
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
        4.1.1 EV712A特異性IgA單克隆抗體的篩選及其對病毒復(fù)制的影響
        4.1.2 EV71VP1特異性IgG單克隆抗體的篩選及其對病毒復(fù)制的影響
    4.2 討論
        4.2.1 關(guān)于EV71非結(jié)構(gòu)蛋白作為免疫靶標(biāo)的選擇
        4.2.2 EV71抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)的測定
    4.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 常用縮寫
作者簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3505400