研究目的:SND1,又稱為p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究發(fā)現(xiàn)其是EB病毒細胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein2）的共活化因子。該蛋白在各物種中分布廣泛,在不同生物中具有高度的保守性,參與調控細胞的多種重要生理過程。SND1蛋白具有調節(jié)基因轉錄和剪接加工pre-m RNA的能力,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但到目前為止,SND1蛋白參與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機制還不清楚,有待于進一步研究。傳統(tǒng)的利用si RNA干擾基因表達研究基因的方法不能在細胞中完全敲除SND1基因的轉錄翻譯,導致SND1蛋白不能完全從細胞中去除,影響對其功能的研究。最新的第三代基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術利用序列特異性的向導RNA分子引導核酸內切酶Cas9對目標靶點的特異性結合與識別,并利用其活性中心對DNA雙鏈進行切割,從而完成對基因組的修飾與編輯。但傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術也存在脫靶效應。而改良的CRISRP/Cas9基因編輯系統(tǒng)的Cas9蛋白可以被改造成為特異性的切口酶,只在特定的DNA位點造成單鏈切口,從而激活細胞內的同源... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

Cas9的結構及其對crRNA的成熟改造

結果2.1 sgRNA 靶點的選擇及寡核酸鏈的設計采用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站確定人類 SND1（NM_014390.2）的基因序列。根據(jù)文獻提示[72]，使用 http://crispr.mit.edu/設計 SND1 基因 double nick的上下游 sgRNA。由于 SND1 基因第一個外顯子區(qū)（expressed region 1, EXON 1）和基因編碼區(qū)（Coding Sequence, CDS）的重疊區(qū)域過短，因此選取第二個外顯子區(qū)進行 sgRNA 設計。sgRNA 設計原則：1）sgRNA 的 5’端第一個堿基若不是 G，則需要在前面加上一個 G；2）以 sgRNA 序列為模版，設計出其互補鏈；3）sgRNA 及其互補鏈分別添加 BbsI 的酶切位點。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)工作示意圖如圖 5。質粒載體如圖 6。設計好的 sgRNA 及其互補鏈如表 1。

圖 6 PX462 質粒圖譜及其酶切位點Fig 6 PX462 vector map and its enzyme loci 重組真核表達質粒 PX462-sgRNA 的酶切結果利用 BbsI 限制性內切酶對構建好的 PX462-sgRNA-A 和 PX462-sgRNA切。結果如圖 7 ，成功構建的質粒不含有 BbsI 酶切位點，因此不能被性，而 PX462 可以被剪切成兩部分。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]人類P100蛋白表達抑制穩(wěn)定株的建立及其對HeLa細胞周期的影響[J]. 何津巖,葛林,邵潔,趙鋼,東莉潔,方建飛,姚智,楊潔.  醫(yī)學分子生物學雜志. 2008(03)
[2]INK 4家族與頭頸腫瘤研究新進展[J]. 劉習強.  國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊. 2002(01)

博士論文
[1]人類p100蛋白對HeLa細胞周期的影響及其機制研究[D]. 何津巖.天津醫(yī)科大學 2008



本文編號：3501851