研究目的:SND1,又稱為p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究發(fā)現(xiàn)其是EB病毒細(xì)胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein2）的共活化因子。該蛋白在各物種中分布廣泛,在不同生物中具有高度的保守性,參與調(diào)控細(xì)胞的多種重要生理過程。SND1蛋白具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和剪接加工pre-m RNA的能力,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但到目前為止,SND1蛋白參與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制還不清楚,有待于進(jìn)一步研究。傳統(tǒng)的利用si RNA干擾基因表達(dá)研究基因的方法不能在細(xì)胞中完全敲除SND1基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,導(dǎo)致SND1蛋白不能完全從細(xì)胞中去除,影響對其功能的研究。最新的第三代基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)利用序列特異性的向?qū)NA分子引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9對目標(biāo)靶點的特異性結(jié)合與識別,并利用其活性中心對DNA雙鏈進(jìn)行切割,從而完成對基因組的修飾與編輯。但傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)也存在脫靶效應(yīng)。而改良的CRISRP/Cas9基因編輯系統(tǒng)的Cas9蛋白可以被改造成為特異性的切口酶,只在特定的DNA位點造成單鏈切口,從而激活細(xì)胞內(nèi)的同源... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Cas9的結(jié)構(gòu)及其對crRNA的成熟改造

結(jié)果2.1 sgRNA 靶點的選擇及寡核酸鏈的設(shè)計采用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站確定人類 SND1（NM_014390.2）的基因序列。根據(jù)文獻(xiàn)提示[72]，使用 http://crispr.mit.edu/設(shè)計 SND1 基因 double nick的上下游 sgRNA。由于 SND1 基因第一個外顯子區(qū)（expressed region 1, EXON 1）和基因編碼區(qū)（Coding Sequence, CDS）的重疊區(qū)域過短，因此選取第二個外顯子區(qū)進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計。sgRNA 設(shè)計原則：1）sgRNA 的 5’端第一個堿基若不是 G，則需要在前面加上一個 G；2）以 sgRNA 序列為模版，設(shè)計出其互補(bǔ)鏈；3）sgRNA 及其互補(bǔ)鏈分別添加 BbsI 的酶切位點。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)工作示意圖如圖 5。質(zhì)粒載體如圖 6。設(shè)計好的 sgRNA 及其互補(bǔ)鏈如表 1。

圖 6 PX462 質(zhì)粒圖譜及其酶切位點Fig 6 PX462 vector map and its enzyme loci 重組真核表達(dá)質(zhì)粒 PX462-sgRNA 的酶切結(jié)果利用 BbsI 限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建好的 PX462-sgRNA-A 和 PX462-sgRNA切。結(jié)果如圖 7 ，成功構(gòu)建的質(zhì)粒不含有 BbsI 酶切位點，因此不能被性，而 PX462 可以被剪切成兩部分。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人類P100蛋白表達(dá)抑制穩(wěn)定株的建立及其對HeLa細(xì)胞周期的影響[J]. 何津巖,葛林,邵潔,趙鋼,東莉潔,方建飛,姚智,楊潔.  醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志. 2008(03)
[2]INK 4家族與頭頸腫瘤研究新進(jìn)展[J]. 劉習(xí)強(qiáng).  國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊. 2002(01)

博士論文
[1]人類p100蛋白對HeLa細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究[D]. 何津巖.天津醫(yī)科大學(xué) 2008



本文編號：3501851