目的:探究人巨細(xì)胞病毒（HCMV）UL111A基因在增殖性感染不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本特征及變化。方法:在HCMV AD169株感染人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）12 h,24 h,48 h,3 d,5 d,7 d,9 d等不同時(shí)間點(diǎn),抽提RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR檢測(cè)UL111A轉(zhuǎn)錄本特征。擴(kuò)增產(chǎn)物通過克隆、測(cè)序驗(yàn)證不同時(shí)間點(diǎn)UL111A轉(zhuǎn)錄本的特征變化。利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建UL111A 3種轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)序列載體pcDNA3.1-cmv IL-10,pc DNA3.1-LAcmvIL-10以及pcDNA3.1-unspliced,Western blot驗(yàn)證構(gòu)建的載體在293T細(xì)胞中的有效表達(dá)。結(jié)果:感染HCMV AD169株的HFF可以檢測(cè)到cmvIL-10,LAcmv IL-10以及未剪切3種形式轉(zhuǎn)錄本。未剪切形式轉(zhuǎn)錄本占比最多,cmvIL-10轉(zhuǎn)錄本占比最少。在感染的24 h和9 d 3種轉(zhuǎn)錄本都有檢測(cè)到,而在其他時(shí)間點(diǎn)未能檢測(cè)到cmvIL-10轉(zhuǎn)錄本。此外,3種轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)序列在293T細(xì)胞中均可有效表達(dá)。結(jié)論:HCMV UL111A基因在增殖性感染不同時(shí)間點(diǎn)存... 

【文章來源】：溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,50(02)

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【部分圖文】：

感染AD169病毒HFF細(xì)胞24 h cDNA反轉(zhuǎn)錄圖

UL111A 3種不同轉(zhuǎn)錄本mRNA和氨基酸模式圖

HCMV是目前已知的最大的皰疹病毒，其編碼大量病毒基因組蛋白包括細(xì)胞因子、趨化因子和它們的受體，在機(jī)體發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能，并且與腫瘤等疾病有密切的關(guān)聯(lián)[7-10]。巨細(xì)胞病毒AD169株完整序列在1990年首次被研究報(bào)道，其編碼了超過200多個(gè)蛋白質(zhì)[11]。在我們的研究中首次報(bào)道了AD169病毒株感染HFF細(xì)胞后，UL111A基因在其增殖性感染的不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄本特征，通過RT-PCR和挑選單克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了cmvIL-10、LAcmvIL-10和未剪切形式轉(zhuǎn)錄本。CmvIL-10蛋白編碼UL111A基因3個(gè)外顯子序列的175個(gè)氨基酸，盡管它與hIL-10只有約27%的同源性，但是它可以通過與hIL-10R結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，如降低單核細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物I(major histocompatibility complex I，MHC I）和MHC II的表達(dá)，降低內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，損傷體外內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲性[12-15]。hIL-10是一個(gè)多效價(jià)的細(xì)胞因子，在機(jī)體炎癥和免疫功能發(fā)揮免疫抑制等作用[16]。LAcmvIL-10蛋白編碼包含第2個(gè)內(nèi)含子序列的139個(gè)氨基酸，其終止密碼子在第2個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，其N端127個(gè)氨基酸與cmvIL-10蛋白相同，C端12個(gè)氨基酸不同，相似的，LAcmvIL-10同樣發(fā)揮一部分的免疫抑制功能，如抑制人初始骨髓細(xì)胞和單核細(xì)胞MHC II的表達(dá)[17]，然而其機(jī)制可能不同于cmvIL-10，如LAcmvIL-10不能誘導(dǎo)stat3的磷酸化，并且其下調(diào)MHC II不能通過hIL-10R的中和抗體拮抗，提示其可能通過其他途徑發(fā)揮功能[18]。未剪切形式蛋白編碼包含兩個(gè)內(nèi)含子序列的78個(gè)氨基酸，其終止密碼子在第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，這與先前的報(bào)道的ORF79高度同源，ORF79是HCMV Towne病毒株上的形態(tài)改變區(qū)域（mtr II），可以發(fā)揮致癌作用誘導(dǎo)惡性形成[19]。之前有研究報(bào)道[20]，在AD169病毒感染的MRC-5細(xì)胞中，共發(fā)現(xiàn)8種轉(zhuǎn)錄本，但是關(guān)于各自生物學(xué)功能尚未進(jìn)行深入研究。我們只發(fā)現(xiàn)其中3種轉(zhuǎn)錄本，可能是由于其他轉(zhuǎn)錄本存在極少，因此未能檢測(cè)到。UL111A基因編碼的cmvIL-10蛋白最早是在感染Towne株病毒的MRC-5細(xì)胞和感染AD169病毒的HEL299細(xì)胞的增殖性感染階段被發(fā)現(xiàn)[4,6]，而其編碼的LAcmvIL-10蛋白則是在感染Toledo株病毒的人粒-巨噬祖細(xì)胞的潛伏感染階段被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究也證明了LAcmvIL-10蛋白同樣存在于感染了Toledo株病毒的HFF細(xì)胞的增殖性感染階段[5,21]。圖3 UL111A 3種不同轉(zhuǎn)錄本mRNA和氨基酸模式圖


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